一种禾花鲤精子冷冻保存方法技术

本发明专利技术公开了一种禾花鲤精子冷冻保存方法，其包括精液采集、精液稀释、精子冷冻保存和精子解冻四个步骤，采用人工腹部挤压法采集禾花鲤的精液，然后将精液与稀释液混合后，再与抗冻液混合得到精子保存液，所述稀释液为D‑15稀释液，Hank’s液和鱼用任氏液中的任意一种；所述抗冻剂为甲醇、二甲基亚砜和甘油中的任意一种；接着将精子保存液注入冻存管中，再浸入液氮长期保存；取用时将装有精子保存液的冻存管从液氮中取出，然后立即置于温度为27℃或37℃或47℃的水浴锅中解冻，再将得到的禾花鲤精子用于人工授精。本发明专利技术方法能够长期保存禾花鲤的精子，且解冻复苏后精子成活率高。

A cryopreservation method of spermatozoa of Cyprinus carpio

【技术实现步骤摘要】
一种禾花鲤精子冷冻保存方法
本专利技术属于生物学低温冷冻保存
，具体涉及一种禾花鲤精子冷冻保存方法。
技术介绍
禾花鲤属鲤科温水性小型鱼类，又称禾花乌鲤﹑禾花鲤﹑禾花鱼﹑乌鲤，体型粗壮，全身略带紫色（乌褐），背部黑色，色彩亮丽，原产于广西桂林，属中国土著鱼类，是具有地方特色的养殖品种。禾花鲤肉质细腻．刺少肉多，骨软无腥味，味道鲜美，蛋白质含量高，且禾花鲤在稻田里混养，食性杂，生长快，繁殖能力强，养殖周期短，具有很高的营养价值和经济价值。随着禾花鲤养殖规模的逐年增加，对禾花鲤种苗的需求也逐渐增大，对禾花鲤种苗的品质要求也逐年提高。人工繁殖可以使禾花鲤集中产卵，提高鱼卵受精率、孵化率和鱼苗成活率，并做到有计划地生产。因为禾花鲤的繁育具有季节性，在非繁育季节时，禾花鲤雄性个体的精子浓度低、精子活性下降，所以需要在繁育季节采集并长期保存禾花鲤的精子，以便于禾花鲤全年的繁育生产需要，提高禾花鲤在非繁育季节时的人工授精效率和育苗成活率，但是目前少有能够长期保存禾花鲤精子以及复苏的方法。
技术实现思路
针对上述不足，本专利技术公开了一种禾花鲤精子冷冻保存方法，能够长期保存禾花鲤的精子，且解冻复苏后精子成活率高。本专利技术是采用如下技术方案实现的：一种禾花鲤精子冷冻保存方法，其包括如下步骤：（1）精液采集：在禾花鲤繁育季节，选择性腺成熟的健壮雄性亲鱼，麻醉后用干毛巾擦干鱼体生殖孔周围水分和黏液，再沿着中线轻轻挤压腹部至生殖孔流出乳白色精液，用注射器吸取精液，防止尿液、血液和水混入，将采集的精液注入冻存管中；（2）精液稀释：先将步骤（1）中采集到的精液与稀释液按照体积比为1:3的比例混合稀释得到溶液A，然后将溶液A与抗冻液按照体积比为1:1的比例混合后得到禾花鲤的精子保存液；所述抗冻液是由以下体积分数的组分组成：10%或20%或30%抗冻剂，余量为稀释液；所述稀释液为D-15稀释液，Hank’s液和鱼用任氏液中的任意一种；所述抗冻剂为甲醇、二甲基亚砜和甘油中的任意一种；（3）精子冷冻保存：将步骤（2）得到的精子保存液注入冻存管中，再将冻存管置于在4℃下平衡30min，接着将冻存管置于液氮表面上方4cm处停留5min，然后将冻存管浸入液氮长期保存；或者将冻存管置于在4℃下平衡30min，接着将冻存管置于液氮表面上方8cm处停留5min，然后将冻存管浸入液氮长期保存；或者将冻存管置于在4℃下平衡30min，接着将冻存管置于液氮表面上方8cm处停留5min，再将冻存管置于液氮表面上方4cm处停留5min，然后将冻存管浸入液氮长期保存；（4）精子解冻：将装有精子保存液的冻存管从液氮中取出，然后立即置于温度为27℃或37℃或47℃的水浴锅中解冻，再将解冻后的精子保存液置于4℃下保存备用。进一步，步骤（2）中所述D-15稀释液是在每100ml纯水中加入0.8gNaCl、0.05gKCl和1.5g葡萄糖混合得到的；所述Hank’s液是在每100ml纯水中加入0.801gNaCl、0.04gKCl、0.014gCaCl2、0.035gNaHCO3、0.006gKH2PO4和0.034g葡萄糖混合得到的；所述鱼用任氏液是在每100ml纯水中加入0.78gNaCl、0.021gCaCl2、0.02gKCl、0.2gNaHCO3混合得到的。进一步，在步骤（3）中所述液氮表面上方4cm处的温度为-92～-88℃；所述液氮表面上方8cm处的温度为-22～-18℃。进一步，步骤（2）中所述抗冻液是置于4℃的温度下保存备用。进一步，在步骤（1）中取10微升采集的精液与等体积的质量分数为0.35%的氯化钾混合后迅速在显微镜下观察精子运动情况，选择精子活率90%以上的精液进行稀释和保存。选择精子活性高的精液进行稀释和保存有利于禾花鲤精子的长期保存，且提高解冻复苏后精子的成活率。本技术方案与现有技术相比较具有以下有益效果：1、本专利技术根据禾花鲤精子特性，合理配制稀释液和抗冻液对禾花鲤的精液稀释处理后，再分步进行降温，防止精子受到冰晶和氧化损伤而影响精子保存效果和解冻后精子的成活率。2、本专利技术冷冻保存过程中设定了三种稀释液、三种抗冻液、三种降温方法、三种复苏温度，且严格控制单一变量进行冷冻条件筛选，所得冷冻保存条件组合具有重要生产参考意义。3、本专利技术降温前将稀释液与抗冻保护剂混合配制成抗冻混合液，并置于4℃冰箱保存备用，操作简便快捷，节省了时间。4、本专利技术方法操作简单、冷冻保存效果好、成本低，可以长期保存禾花鲤的精子，实现禾花鲤种质资源的永久保存，而且能够在禾花鲤的繁育季节大量挑选保存优质精液，用于禾花鲤全年的人工繁育生产。具体实施方式以下通过实施例进一步说明本专利技术，但不作为对本专利技术的限制。下列实施例中未注明的具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1：一种禾花鲤精子冷冻保存方法，其包括如下步骤：（1）精液采集：在禾花鲤繁育季节，选择性腺成熟的健壮雄性亲鱼，麻醉后用干毛巾擦干鱼体生殖孔周围水分和黏液，再沿着中线轻轻挤压腹部至生殖孔流出乳白色精液，用注射器吸取精液，防止尿液、血液和水混入，将采集的精液注入冻存管中；取10微升采集的精液与等体积的质量分数为0.35%的氯化钾混合后迅速在显微镜下观察精子运动情况，选择精子活性高的精液进行稀释和保存；（2）精液稀释：先将步骤（1）中采集到的精液与稀释液按照体积比为1:3的比例混合稀释得到溶液A，然后将溶液A与抗冻液按照体积比为1:1的比例混合后得到禾花鲤的精子保存液；所述抗冻液是由以下体积分数的组分组成：20%抗冻剂，余量为稀释液；所述稀释液为D-15稀释液；所述抗冻剂为二甲基亚砜；所述D-15稀释液是在每100ml纯水中加入0.8gNaCl、0.05gKCl和1.5g葡萄糖混合得到的；所述抗冻液是置于4℃的温度下保存备用；（3）精子冷冻保存：将步骤（2）得到的精子保存液注入冻存管中，再将冻存管置于在4℃下平衡30min，接着将冻存管置于液氮表面上方4cm处停留5min，然后将冻存管浸入液氮长期保存；液氮表面上方4cm处的温度为-90℃；（4）精子解冻：将装有精子保存液的冻存管从液氮中取出，然后立即置于温度为37℃的水浴锅中解冻，再将解冻后的精子保存液置于4℃下保存备用。按照本实施例所述方法进行禾花鲤精子的冷冻保存，然后吸取10微升解冻后精液与等体积的质量分数为0.35%的氯化钾混合后迅速在显微镜下观察精子运动情况，激活后用显微镜检测冻精活率为79.43%±1.01%，平均直线速度为8.35±4.92微米/秒，平均曲线速度为25.97±9.72微米/秒，平均路径速度为22.46±8.76微米/秒。实施例2：一种禾花鲤精子冷冻保存方法，其包括如下步骤：（1）精液采集：在禾花鲤繁育季节，选择性腺成熟的健壮雄性亲鱼，麻醉后用干毛巾擦干鱼体生殖孔周围水分和黏液，再沿着中线轻轻本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种禾花鲤精子冷冻保存方法，其特征在于：包括如下步骤：/n（1）精液采集：在禾花鲤繁育季节，选择性腺成熟的健壮雄性亲鱼，麻醉后用干毛巾擦干鱼体生殖孔周围水分和黏液，再沿着中线轻轻挤压腹部至生殖孔流出乳白色精液，用注射器吸取精液，防止尿液、血液和水混入，将采集的精液注入冻存管中；/n（2）精液稀释：先将步骤（1）中采集到的精液与稀释液按照体积比为1:3的比例混合稀释得到溶液A，然后将溶液A与抗冻液按照体积比为1:1的比例混合后得到禾花鲤的精子保存液；所述抗冻液是由以下体积分数的组分组成：10%或20%或30%抗冻剂，余量为稀释液；所述稀释液为D-15稀释液，Hank’s液和鱼用任氏液中的任意一种；所述抗冻剂为甲醇、二甲基亚砜和甘油中的任意一种；/n（3）精子冷冻保存：将步骤（2）得到的精子保存液注入冻存管中，再将冻存管置于在4℃下平衡30min，接着将冻存管置于液氮表面上方4cm处停留5min，然后将冻存管浸入液氮长期保存；或者将冻存管置于在4℃下平衡30min，接着将冻存管置于液氮表面上方8cm处停留5min，然后将冻存管浸入液氮长期保存；或者将冻存管置于在4℃下平衡30min，接着将冻存管置于液氮表面上方8cm处停留5min，再将冻存管置于液氮表面上方4cm处停留5min，然后将冻存管浸入液氮长期保存；/n（4）精子解冻：将装有精子保存液的冻存管从液氮中取出，然后立即置于温度为27℃或37℃或47℃的水浴锅中解冻，再将解冻后的精子保存液置于4℃下保存备用。/n...

【技术特征摘要】
1.一种禾花鲤精子冷冻保存方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）精液采集：在禾花鲤繁育季节，选择性腺成熟的健壮雄性亲鱼，麻醉后用干毛巾擦干鱼体生殖孔周围水分和黏液，再沿着中线轻轻挤压腹部至生殖孔流出乳白色精液，用注射器吸取精液，防止尿液、血液和水混入，将采集的精液注入冻存管中；
（2）精液稀释：先将步骤（1）中采集到的精液与稀释液按照体积比为1:3的比例混合稀释得到溶液A，然后将溶液A与抗冻液按照体积比为1:1的比例混合后得到禾花鲤的精子保存液；所述抗冻液是由以下体积分数的组分组成：10%或20%或30%抗冻剂，余量为稀释液；所述稀释液为D-15稀释液，Hank’s液和鱼用任氏液中的任意一种；所述抗冻剂为甲醇、二甲基亚砜和甘油中的任意一种；
（3）精子冷冻保存：将步骤（2）得到的精子保存液注入冻存管中，再将冻存管置于在4℃下平衡30min，接着将冻存管置于液氮表面上方4cm处停留5min，然后将冻存管浸入液氮长期保存；或者将冻存管置于在4℃下平衡30min，接着将冻存管置于液氮表面上方8cm处停留5min，然后将冻存管浸入液氮长期保存；或者将冻存管置于在4℃下平衡30min，接着将冻存管置于液氮表面上方8cm处停留5min，再将冻存管置于液氮表面上方4cm处停留5min，然后将冻存管浸入液氮长期保存；
（4）精子解冻：将装有精子保存液的冻存管从液氮中取...

【专利技术属性】
技术研发人员：张曼，谭虹雨，陈秀荔，杨春玲，王振光，杨艳艳，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：广西;45