用于改进药物递送的包含钉合肽或拼接肽的化合物制造技术

本发明专利技术涉及药物递送方面的改进以及细胞穿透剂(CPA)或细胞穿透肽(CPP)的用途，这些细胞穿透剂或细胞穿透肽已通过例如以下方式稳定化：i)钉合两个氨基酸以形成钉合CPP(StaP)或ii)拼接三个或更多个氨基酸以形成拼接CPP(StiP)。更具体地，提供了一种携带药物的细胞穿透分子(DCCPM)，其包含：生物活性化合物(BAC)、和细胞穿透剂(CPA)，该BAC和该CPA直接或经由双功能接头(BFL)连接。该CPA是通过钉合以形成钉合肽(StaP)或通过拼接以形成拼接肽(StiP)而具有施加于其上的构象的稳定肽(CPP)。该StiP或StaP包含该肽的至少两个氨基酸之间的交联或桥接，并且该交联或桥接提供了在至少两个氨基酸之间的不是通过烯烃复分解形成的环化。环化可通过以下中的一种或多种方式实现：醛或酮与肼或受保护的肼的缩合；硫醇‑烯迈克尔加成；二硫化物形成；Huisgen 1,3偶极环加成；胺与羧酸之间的反应；基于单重态或三重态的卡宾反应；或铃木偶联或薗头偶联。

Compounds containing stapled or spliced peptides for improved drug delivery

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于改进药物递送的包含钉合肽或拼接肽的化合物本专利技术涉及药物递送的改进。更特别地，本专利技术涉及细胞穿透剂(CPA)的用途，并且更特别地还涉及已经通过例如以下方式稳定的细胞穿透肽(CPP)的用途：i)钉合两个氨基酸以形成钉合CPP(StaP)或ii)拼接三个或更多个氨基酸以形成拼接CPP(StiP)。本专利技术与申请人较早的专利申请PCT/GB2016/054028的不同之处在于使用与烯烃复分解不同的化学反应来稳定肽。这些化学反应提供了肽的至少两个氨基酸之间的交联或桥接，并且该交联或桥接提供了该至少两个氨基酸之间的环化。在这些替代性化学反应中，环化是通过以下中的一种或多种方式实现：i.醛或酮与肼或受保护的肼的缩合；ii.硫醇-烯迈克尔加成；iii.二硫化物形成；iv.Huisgen1,3偶极环加成；v.胺与羧酸之间的反应；vi.基于单重态或三重态的卡宾反应；或vii.铃木偶联或薗头偶联。这些StaP或StiP可以由单个或多个钉合物或拼接物构成，并且沿着肽序列可以是连续的或不连续的。这些稳定CPP直接或经由双功能接头(BFL)与药物或生物活性化合物(BAC)缀合，使得BAC可由CPP携带穿过细胞膜。所得到的分子称为携带药物的细胞穿透分子(DCCPM)。以这种方式递送的优选BAC是寡核苷酸(ON)，更优选地是携带低电荷的寡核苷酸(在pH7.5下-3至+3电荷)并且最优选地是电中性的寡核苷酸(在pH7.5下-1至+1电荷)，例如但不限于肽核酸(PNA)、磷酸二酰胺吗啉代寡核苷酸(PMO)或其修饰衍生物。可替代地，稳定CPP直接或经由BFL与ON缀合时，可以与作为DNA、RNA或蛋白质分子的BAC共价或非共价缔合，这样BAC可以由CPP缀合的ON携带穿过细胞膜。所得到的分子称为药物靶向性细胞穿透分子(DTCPM)。优选的BFL可以被聚乙二醇化，包含含有修饰(例如胺基)的聚乙二醇(PEG)基团，或掺入间隔物，例如β-Ala。这些修饰可以改善增溶或在官能部分之间提供适当的间隔。本专利技术还涉及促进BAC摄入细胞中的方法，DCCPM在需要改变内源或外源基因的疾病的治疗中的用途，提高药物或BAC的生物利用度的方法，将药物或BAC引入用天然状态下的该药物或BAC难治的位点的方法，包括施用本专利技术的DCCPM的治疗受试者的方法，并且涉及包含该DCCPM和其药物盐、和一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。本专利技术还涉及促进作为DNA、RNA或蛋白质分子的BAC摄入细胞中的方法，DTCPM在需要改变内源或外源基因的疾病的治疗中的用途，提高药物或BAC的生物利用度的方法，将药物或BAC引入用天然状态下的该药物或BAC难治的位点的方法，包括施用本专利技术的DTCPM的治疗受试者的方法，并且涉及包含DTCPM和一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。根据具体实施方式，再另外的方面将是清楚的。
技术介绍
在治疗所有疾病时，希望将药物或BAC以在最小毒性下确保最大效果的方式递送到体内，并且更优选地递送到靶位点的细胞中。这可能具有挑战性。以靶向方式递送的药物或BAC的实例是寡核苷酸(ON)，该术语包括ON类似物。ON可靶向必需DNA、RNA和蛋白质序列，并可以按许多方式调节基因表达，这些方式包括空间阻断以抑制(i)RNA剪接，(ii)蛋白质翻译或(iii)其他核酸:核酸或核酸:蛋白质相互作用。具体地讲，ON与特定RNA序列基序的杂交防止了剪接体的正确装配，从而不能识别前体mRNA中的靶外显子，因此排除成熟基因转录物中的这些外显子。排除框内外显子可导致截短但仍具功能性的基因产物；排除框外外显子导致转录物的移码，可能导致提前终止密码子和降低靶基因表达水平。同样地，ON可以经由调节RNA剪接以从成熟的mRNA转录物中排除基因的特定外显子，从而改变细胞蛋白质含量。总之，这已导致针对诸如杜氏肌营养不良症(排除外显子)和脊髓性肌萎缩(包含外显子)等病症的转化项目1,2，并随后获得了市场批准。另外，ON可被设计为靶向一种或多种病毒基因转录物的5'翻译起始位点以防止翻译机构的结合。使用反义寡核苷酸(AO)抑制病毒翻译是一项非常完善的技术3，并已进入病毒性出血热(诸如马尔堡和埃博拉4,5)的临床试验。但AO可以被设计为靶向内源表达基因的5'翻译起始位点。而且，ON可被设计为靶向内源转录物的可改变核输出、翻译和转录物稳定性的3'非翻译区。此类靶标包括而不限于转录物的聚腺苷酸化和/或切割位点。另外，ON可被设计为形成适体，使得二级和三级结构可结合蛋白质或其他细胞靶标，从而影响特定基因表达水平或其他细胞过程(例如翻译后修饰)。基于空间阻断的抑制优于RNA诱导的沉默复合物的基于siRNA/RNAi的RNA酶H诱导的优点是降低了脱靶副作用的可能性。ON产生带负电荷的主链的修饰提高了稳定性6-9，但是这些主链化学物质(例如2'O-硫代磷酸甲酯类似物)引起膜毒性问题，在临床转化时引起血小板减少症和注射位点问题10，使得即使在施用方案变得越来越间歇时11，效力受到毒性问题阻碍。实际上，WO2013/150338和WO2014/053622均披露了通过将它们与等于或大于15个氨基酸并在15-27个氨基酸范围内的带正电荷的直链或钉合肽进行络合来递送小尺寸(通常小于1.5KDa)的带负电荷的ON。JACS,第136卷,2014,GJHilinski等人描述了能够穿透细胞的钉合肽和拼接肽。参考这些肽可用于递送寡核苷酸的可能性，推测是以与上面公开的国际申请中公开的相同的方式，即通过络合。没有提出通过将BAC与CPA共价连接，任选地经由BFL产生更大尺寸(大于1.5KDa，直至2.5Kda、5KDa、7.5KDa、10KDa、12.5KDa或更大)的新实体，实际上，先前的方法要求各自组分具有相反的电荷以促进络合。使用直接或间接用BFL(共价地)缀合的携带低电荷的寡核苷酸(在pH7.5下-3至+3电荷)和最优选地电中性的寡核苷酸(在pH7.5下-1至+1电荷)，诸如但不限于肽核酸(PNA)、磷酸二酰胺吗啉代寡核苷酸(PMO)是不明显的，实际上，限制该ON上的电荷进一步允许使用更小的肽(长度小于15个氨基酸，至14、13、12、11、10、9、8、7、6至仅5或4个氨基酸)作为载体。使用不带电荷的ON主链，诸如磷酸二酰胺吗啉代寡核苷酸(PMO)代表有吸引力的BAC，因为它们在临床前和临床环境中具有无可挑剔的安全记录2,4,12-14。然而，它们穿透细胞并接近其靶标的能力由于其不带电荷的性质而受到损害15。因此，克服促进ON进入细胞的问题是希望的。以靶向方式递送的药物或BAC的其他实例是DNA分子(包括直链和环状分子)、RNA分子和肽。包括蛋白质增强和病毒介导的基因增强策略在内的此类策略已经是许多药物开发的基石，但是靶向问题和货物递送的效率可能构成相当大的问题。再次，克服促进此类基于DNA、RNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种携带药物的细胞穿透分子(DCCPM)，其包含：/ni.生物活性化合物(BAC)，和/nii.细胞穿透剂(CPA)，该BAC和该CPA直接或经由双功能接头(BFL)连接，/n该CPA是通过钉合以形成钉合肽(StaP)或通过拼接以形成拼接肽(StiP)而具有施加于其上的构象的稳定肽(CPP)，该StiP或StaP包含该肽的至少两个氨基酸之间的交联或桥接，并且该交联或桥接提供了在所述至少两个氨基酸之间的不是通过烯烃复分解形成的环化。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170628 GB 1710322.71.一种携带药物的细胞穿透分子(DCCPM)，其包含：
i.生物活性化合物(BAC)，和
ii.细胞穿透剂(CPA)，该BAC和该CPA直接或经由双功能接头(BFL)连接，
该CPA是通过钉合以形成钉合肽(StaP)或通过拼接以形成拼接肽(StiP)而具有施加于其上的构象的稳定肽(CPP)，该StiP或StaP包含该肽的至少两个氨基酸之间的交联或桥接，并且该交联或桥接提供了在所述至少两个氨基酸之间的不是通过烯烃复分解形成的环化。


2.如权利要求1所述的DCCPM，其中环化是通过以下中的一种或多种方式实现：
i.醛或酮与肼或受保护的肼的缩合；
ii.硫醇-烯迈克尔加成；
iii.二硫化物形成；
iv.Huisgen1,3偶极环加成；
v.胺与羧酸之间的反应；
vi.基于单重态或三重态的卡宾反应；或
vii.铃木偶联或薗头偶联。


3.如权利要求2所述的DCCPM，其中在iv)中，在含有叠氮化物或缺电子腈的氨基酸与含有炔丙基的氨基酸之间形成三唑。


4.如权利要求3所述的DCCPM，其中该叠氮化物是叠氮赖氨酸。


5.如权利要求3所述的DCCPM，其中该含有炔丙基的氨基酸是赖氨酸、谷氨酸或天冬氨酸。


6.如权利要求2所述的DCCPM，其中在v)中，在含有游离胺的氨基酸与含有羧酸的氨基酸之间形成内酰胺。


7.如权利要求6所述的DCCPM，其中该内酰胺是通过赖氨酸与谷氨酸或天冬氨酸交联形成的。


8.如前述权利要求中任一项所述的DCCPM，其中每个交联的标称连续长度为2-20个原子。


9.如前述权利要求中任一项所述的DCCPM，其中该稳定肽包含至少一个α螺旋、延伸的310-螺旋或聚(Pro)II螺旋。


10.如权利要求1至8中任一项所述的DCCPM，其中该稳定肽包含至少一个β折叠或发夹或转角。


11.如权利要求9或10所述的DCCPM，其中该稳定肽包含至少一个α螺旋、延伸的310-螺旋或聚(Pro)II螺旋以及一个β折叠、转角或发夹。


12.如前述权利要求中任一项所述的DCCPM，其中该BAC是寡核苷酸(ON)。


13.如权利要求12所述的DCCPM，其中该ON是携带低电荷的ON。


14.如权利要求13所述的DCCPM，其中该ON是携带中性电荷的ON。


15.如权利要求13或14所述的DCCPM，其中该ON是肽核酸(PNA)或磷酸二酰胺吗啉代寡核苷酸(PMO)或其变体。


16.如权利要求12至15中任一项所述的DCCPM，其中该ON是反义寡核苷酸(AO)。


17.如权利要求16所述的DCCPM，其中该ON是包含选自表4的化合物的化学物质的反义寡核苷酸，包括具有杂交体化学性质的ON。


18.如权利要求12所述的DCCPM，其中该BAC是磷酸二酰胺吗啉代寡核苷酸(PMO)。


19.如前述权利要求中任一项所述的DCCPM，其中该BAC改变内源或外源基因的表达。


20.如权利要求19所述的DCCPM，其中该内源基因靶向神经肌肉疾病、代谢疾病、癌症、与年龄相关的退行性疾病或获得性病毒感染。


21.如前述权利要求中任一项所述的DCCPM，其中该BFL包含选自表6的化学物质的化学物质。


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【专利技术属性】
技术研发人员：基思·福斯特，亚当·詹姆斯·雷金纳德·加德，
申请(专利权)人：苏图拉医疗有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB