基因AlgL23具有冷适应性的用途制造技术

本发明专利技术公开了基因AlgL23具有冷适应性的用途。能够在4℃时酶活依旧有最大酶活的48％，具有较为优良的冷适应性。

The application of gene algl23 in cold adaptability

【技术实现步骤摘要】
基因AlgL23具有冷适应性的用途
本专利技术涉及基因用途领域，尤其涉及基因AlgL23具有冷适应性的用途。
技术介绍
褐藻胶是一种含量最丰富的褐藻多糖，由L-古罗糖醛酸(α-L-guluronicacid，简称G)和D-甘露糖醛(β-D-mannuronicacid，简称M)两种单元通过1,4-糖苷键连接而成。其组合方式有以下3种，即：均聚古罗糖醛酸片段(Poly-gulutonate，Poly-G)、均聚甘露糖醛酸片段(Poly-mannuronate，Poly-M)和甘露糖醛酸-古洛糖醛酸混合嵌合片段(Poly-MG)。目前，褐藻胶降解的方法主要有化学降解法、物理降解法和酶解法，相比而言，酶促降解褐藻胶更有优势，其效率高、无毒副产物，更适于褐藻胶寡糖的制备。通过酶法降解获得的源自褐藻胶的各种寡糖具有促进植物生长、抗氧化、抗凝血、抗肿瘤、抗过敏、抗增殖和抗过敏活性等生理功能和生物活性。低聚糖和寡糖因分子量小，容易被利用，其功能活性往往较多糖高，应用更为广泛。以微藻和大型褐藻为底物的第三代生物能源，更是目前引起国内外广泛关注的热点。海藻是生产生物燃料的一种理想原料，具有很大的潜力。海藻的生物构造特征赋予它一种优于木质纤维素生物质的优势，易于高产，且避开了发酵前的耗能性预处理和水解过程。然而，目前尚未实现由海藻生产乙醇的全部潜能，主要是因为工业微生物不能代谢海藻多糖组分，必须先降解为单糖或寡糖后才能被微生物利用。因此，褐藻胶裂解酶温和降解褐藻胶成为大型褐藻利用的关键点。自然界中广泛存在着褐藻胶裂解酶，水体系统中的微生物、软体动物和藻类，陆地系统中的微生物以及病毒等都有褐藻胶裂解酶的存在。目前已有不少褐藻胶裂解酶的基因得到克隆和测序，并构建出多种重组褐藻多糖裂解酶基因工程菌，但重组褐藻多糖裂解酶基因工程表达水平较低，限制了酶的应用。因此，利用基因工程手段，进一步获得具有优良特性的褐藻多糖裂解酶仍是本
的当务之急。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基因AlgL23具有冷适应性的用途。为实现上述目的，本专利技术提供一种基因AlgL23和/或含有基因AlgL23的载体具有冷适应性的用途。进一步，所述冷适应性是指能在4-55℃下具有较大酶活。进一步，所述冷适应性是指能在4-50℃下具有较大酶活。本专利技术还提供基因AlgL23和/或含有基因AlgL23的载体具有作用于海带产生还原糖的用途。本专利技术通过设计特异性引物获得褐藻胶裂解酶的AlgL23的DNA序列，该基因编码区长2223bp，编码740个氨基酸，其中1-28个氨基酸为信号肽，理论分子量为82.59kDa。大肠杆菌重组表达获得的AlgL23具有较高酶活性和冷适应性，该酶在低温下依旧可以保持较好的酶活性，在4℃下反应，酶活可以保留最大酶活的接近48.94％。相较于其他来源的酶这无疑是非常有优势的。作为实施例的优选方式，此褐藻胶裂解酶催化水解的温度范围为4-50℃，最适温度为35℃，并且该酶在40℃下处理60min依旧可以保留55％的剩余活力。水解的pH范围为5-9，最适pH为6，在pH5-7条件下处理2h，依旧可以保留最大酶活的55％以上。Mn2+对该酶的促进作用比较明显，Cu2+则对该酶有明显的抑制作用。附图说明图1为褐藻胶裂解酶基因AlgL23重组表达纯化的SDS-PAGE图谱。图2为本专利技术温度对褐藻胶裂解酶AlgL23活性影响曲线图；图3为本专利技术温度对褐藻胶裂解酶AlgL23稳定性影响曲线图；图4为本专利技术pH对褐藻胶裂解酶AlgL23活性影响曲线图；图5为本专利技术pH对褐藻胶裂解酶AlgL23稳定性影响曲线图；图6为本专利技术金属离子对褐藻胶裂解酶AlgL23活性影响曲线图；图7为抑制剂及去污剂对酶活性的影响表格图；图8为本专利技术褐藻胶裂解酶AlgL23作用于海带粉曲线图。具体实施方式下面详细描述本专利技术的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。生物材料来源PseudoalteromonascarrageenovoraASY5,中文名称为食鹿角菜假交替单胞菌，分离自厦门红树林土壤腐叶样品，来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，保藏编号23819。实施例1：具有冷适应性的褐藻胶裂解酶AlgL23基因的获得将PseudoalteromonascarrageenovoraASY5接种至人工海水培养基中，在25℃，180r/min的条件下，震荡培养至OD600为1-1.5，取培养菌液1mL，利用东盛生物细菌基因组快速提取试剂盒(硅胶膜离心柱法)提取PseudoalteromonascarrageenovoraASY5菌株基因组DNA。上述人工海水培养基配置方法如下：人工海水培养基：牛肉浸膏10g、胰蛋白胨10g、蒸馏水250mL、人工海水750mL(NaCl37.51g、KCl1.03g、CaCl21.61g、MgCl2·6H2O6.4g、NaHCO30.15g、MgSO4·7H2O4.67g、蒸馏水1000mL)。牛肉浸膏和胰蛋白胨在蒸馏水中溶解后用NaOH调pH至7.8，加热煮沸10min，冷却后再次加NaOH调pH至7.3，然后和人工海水混合，121℃灭菌20min。固体培养基再添加20g琼脂。以PseudoalteromonascarrageenovoraASY5菌株基因组DNA为模板，设计引物进行PCR扩增，引物序列如下：正向引物AlgL23-F：5’-CGCGGATCCATGATGAATTTATCTCGAAG-3’；SEQIDNO:3；反向引物AlgL23-R：5’-CCGGAATTCCTCCTGAGTATTCTTCAACG-3’；SEQIDNO:4。正向引物AlgL23-F下划线标注的是限制性内切酶位点BamHI，反向引物AlgL23-R下划线标注的是限制性内切酶EcoRI位点。所用高保真DNA聚合酶PrimeSTARHS购自中国大连TaKaRa生物公司，所用PCR反应试剂按照该公司提供的产品说明进行操作。PCR反应系统为：PCR条件为：95℃，5min；94℃，15s；55℃，15s，72℃，1min，30次循环，最后72℃，10min。得到PCR产物即为褐藻胶裂解酶AlgL23基因。实施例2：序列分析利用NCBI的BLAST程序在GenBank数据库中进行核酸序列及氨基酸序列的同源性搜索，利用SMART数据库的信号肽预测工具S本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基因AlgL23和/或含有基因AlgL23的载体具有冷适应性的用途。/n

【技术特征摘要】
1.基因AlgL23和/或含有基因AlgL23的载体具有冷适应性的用途。


2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述冷适应性是指能在4-55℃下具有较大酶活，以35℃时的最高酶活为100％，4℃时酶活依旧有最...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖安风，焦超，陈培旭，张永辉，翁慧芬，肖琼，杨秋明，
申请(专利权)人：集美大学，
类型：发明
国别省市：福建;35