马尾松长叶烯合成酶基因和产品及用途制造技术

本发明专利技术涉及植物分子生物学领域，具体而言，提供了一种马尾松长叶烯合成酶基因和产品及用途。本发明专利技术首次从马尾松中克隆得到马尾松长叶烯合成酶基因，并确定其核苷酸序列(SEQ ID NO.1)以及氨基酸序列(SEQ ID NO.2)，填补了现有技术中对马尾松中萜烯类合成酶及其生物合成基因未知的空白，为马尾松的相关研究提供了理论和基础支持。此外，发明专利技术人通过将马尾松长叶烯合成酶基因重组得到重组载体和工程菌，并且成功纯化得到马尾松长叶烯合成酶，在体外酶活实验中该酶可将法基尼焦磷酸催化合成长叶烯和α‑蒎烯，对植食性病虫害防御具有重要意义。

Gene, product and application of Longifolene synthetase from Pinus massoniana

【技术实现步骤摘要】
马尾松长叶烯合成酶基因和产品及用途
本专利技术涉及植物分子生物学领域，具体而言，涉及一种马尾松长叶烯合成酶基因和产品及用途。
技术介绍
马尾松(PinusmassonianaLamb.)速生、耐干旱瘠薄、适应性强，是我国南方荒山造林的先锋树种，在一些地理条件较差的山地，马尾松甚至是唯一可造林的本土树种。马尾松广泛分布在我国亚热带17个省(区、市)，根据第八次全国森林资源清查结果(2016年)，马尾松林面积约为1001万公顷，而且马尾松年产松脂总量为60-80万吨，约占我国松脂总量的70％。因此，马尾松在我国速生丰产材用和脂用林基地建设中占据极其重要的地位。马尾松松脂成分主要为一些萜类物质，单萜，倍半萜以及二萜等。萜烯类化合物为马尾松主要次生代谢物质，植食性昆虫诱导的植物挥发物的重要成分，是病原入侵后的第一道防线。然而，目前关于马尾松中萜烯类合成酶的生物合成基因还未被分离和鉴定。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种马尾松长叶烯合成酶基因，以填补现有技术对马尾松中萜烯类合成酶及其生物合成基因未知的空白。本专利技术第二目的在于提供马尾松长叶烯合成酶基因的扩增引物对，可以快速、准确得到马尾松长叶烯合成酶基因。本专利技术的第三目的在于提供马尾松长叶烯合成酶及其在生产长叶烯和/或α-蒎烯中的应用，填补现有技术中缺少马尾松长叶烯合成酶的空白，同时提供该合成酶的工业应用。本专利技术的第四目的在于提供一种长叶烯和/或α-蒎烯的生产方法，填补现有技术中缺少可以利用生物技术工业化生产长叶烯和/或α-蒎烯方法的空白。本专利技术的第五目的在于提供含有马尾松长叶烯合成酶基因的重组载体和工程菌及其应用，为马尾松长叶烯合成酶的获取和利用提供更简便的生物模块。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种马尾松长叶烯合成酶基因，马尾松长叶烯合成酶基因核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。马尾松长叶烯合成酶基因的扩增引物对，所述扩增引物对如下：正向引物为：5’-CAAGATTGGATTCGGTGAAG-3’(SEQIDNO.3)；反向引物为：5’-GCGGAGATATCCGATCTTGA-3’(SEQIDNO.4)。一种马尾松长叶烯合成酶，马尾松长叶烯合成酶氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。马尾松长叶烯合成酶在生产长叶烯和/或α-蒎烯中的应用。一种长叶烯和/或α-蒎烯的生产方法，利用上述马尾松长叶烯合成酶催化法尼基焦磷酸，得到长叶烯和/或α-蒎烯。一种含有马尾松长叶烯合成酶基因的重组载体，所述重组载体包括马尾松长叶烯合成酶基因和载体；马尾松长叶烯合成酶基因核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。进一步地，所述载体包括表达载体或克隆载体；优选地，表达载体包括pET-28a；优选地，克隆载体包括pClone007。一种含有马尾松长叶烯合成酶基因的工程菌，所述工程菌包括马尾松长叶烯合成酶基因和宿主细胞，马尾松长叶烯合成酶基因核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。进一步地，所述宿主细胞包括大肠杆菌DH5α或大肠杆菌BL21。含有马尾松长叶烯合成酶基因的重组载体，或，工程菌，在生产长叶烯和/或α-蒎烯中的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术首次从马尾松中克隆得到马尾松长叶烯合成酶基因，并确定其核苷酸序列以及氨基酸序列，填补了现有技术中对马尾松中萜烯类合成酶及其生物合成基因未知的空白，为马尾松的相关研究提供了理论和基础支持。此外，专利技术人通过将马尾松长叶烯合成酶基因重组得到重组载体和工程菌，并且成功纯化得到马尾松长叶烯合成酶，在体外酶活实验中该酶可将法基尼焦磷酸催化合成长叶烯和α-蒎烯，对植食性病虫害防御具有重要意义。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为实施例1中的马尾松长叶烯合成酶基因的PCR片段；图2为实施例3中的SDS-PAGE分析马尾松长叶烯合成酶上清纯化结果，其中，泳道1：marker(kDd)；泳道2：诱导前；泳道3：诱导后；泳道4：P破菌沉淀；泳道5：Pre上柱流出液；泳道6：Aft流出蛋白；泳道7：5％洗杂蛋白；泳道8：30％洗脱蛋白；泳道9：100％洗脱蛋白；图3为实施例3中的western-blot检测马尾松长叶烯合成酶纯化结果；图4为实施例4中的GC-MS检测α-蒎烯图谱；图5为实施例4中的α-蒎烯的离子特征峰与谱库比对结果；图6为实施例4中的GC-MS检测长叶烯图谱；图7为实施例4中的长叶烯离子特征峰与谱库对比结果。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本专利技术中。马尾松长叶烯合成酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术首次从马尾松中克隆得到马尾松长叶烯合成酶基因(在本专利技术中又可称为“66887”)，并确定其核苷酸序列以及氨基酸序列，填补了现有技术中对马尾松中萜烯类合成酶及其生物合成基因未知的空白，为马尾松的相关研究提供了理论和基础支持。马尾松长叶烯合成酶基因的核苷酸序列如下：ATGGCTCAAATTTCTATAGGTGCACCACTATCTGCCGAGGTGAACGGATCCTGCATCAACACTCATCATCATGGAAATCTGTGGGACGACTATTTCATACAATCTCTTAAGTCGCCTTATGAGGCACCTGAATGTCATGAACGCTGTGAAAAGATGATTGAAGAAGTGAAGCATTTACTTTTGAGTGAGATGAGAGATGGCAACGATGATTTAATCAAACGTCTCCAGATGGTTGACATTTTTGAATGTCTAGGAATTGATCGGCACTTTCACCATGAAATACAAGCTGCTCTTGATTACGTGTACAGATATTGGAACGAGCTGGAAGGCATCGGTGTTGGAACAAGAGATTCCCTCACCAAAGATCTCAATGCTACGGGTTTGGGATTTCGGGCTCTCCGACTCCATCGATATAACGTATCCTCAGCTGTCTTGGAGAATTTCAAGAACGAAAATGGGCTGTTCTTCCACAGTTCCACGGTTCAAGAAGAAGAAGTGAGATGC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种马尾松长叶烯合成酶基因，其特征在于，马尾松长叶烯合成酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种马尾松长叶烯合成酶基因，其特征在于，马尾松长叶烯合成酶基因核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.权利要求1所述马尾松长叶烯合成酶基因的扩增引物对，其特征在于，所述扩增引物对如下：
正向引物为SEQIDNO.3：5’-CAAGATTGGATTCGGTGAAG-3’；
反向引物为SEQIDNO.4：5’-GCGGAGATATCCGATCTTGA-3’。


3.一种马尾松长叶烯合成酶，其特征在于，马尾松长叶烯合成酶氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。


4.权利要求3所述的马尾松长叶烯合成酶在生产长叶烯和/或α-蒎烯中的应用。


5.一种长叶烯和/或α-蒎烯的生产方法，其特征在于，利用权利要求3所述的马尾松长叶烯合成酶催化法尼基焦磷酸，得到长叶烯和/或α-蒎烯。


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【专利技术属性】
技术研发人员：刘彬，刘青华，周志春，
申请(专利权)人：中国林业科学研究院亚热带林业研究所，
类型：发明
国别省市：浙江;33