一种果胶酶人工序列及其表达方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种果胶酶人工序列及其表达方法和应用，该基因至少含有下列核苷酸序列之一的DNA片：1)序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列；2)与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有90％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列；或3)与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列杂交且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列。按照本发明专利技术所述的基因序列进一步构建重组载体并转化酵母，可实现该重组果胶酶在甲醇诱导下的分泌表达，通过DEAE阴离子交换纯化，可得到纯度高于95％活性重组果胶蛋白，该活性酶蛋白具有很强的澄清果汁的活性。

An artificial sequence of pectinase and its expression method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种果胶酶人工序列及其表达方法和应用
本专利技术属于生物分子克隆
，涉及一种高活力果胶酶基因的人工序列及其重组蛋白的制备方法与应用。
技术介绍
我国是世界上水果生产的大国，近十年来，我国水果总产量保持在四千五百万吨以上。水果资源丰富，为我国果汁工业的发展,提供了良好的基础。目前，果汁市场竞争激烈，品牌众多，许多加工企业都陷入困境，如何发展果汁工业，已成为一个值得重视的课题。果汁生产中的一大瓶劲是产生的果汁较为混浊，从而影响了果汁的品质与口感。利用果胶酶澄清果蔬汁由来已久，早在20世纪30年代已有所应用。通常果蔬汁产品都有浑浊、沉淀的现象，不仅会影响产品外观，而且还直接影响到果蔬汁的质量和稳定性。因此，在加工过程中都要进行澄清处理。在果胶酶作用下果蔬汁中的果胶部分水解后，通过离心、过滤，可将絮凝物除去，从而达到澄清的目的。因此，开发具有高活性的果汁澄清用的果胶酶迫在眉睫。专利技术人的前期研究中发现了一种高活力的源自于茯苓的新型高活性果胶酶，但该酶在茯苓中的表达量很低，因此利用外源基因表达系统高效表达该新型重组酶蛋白是开发该果胶酶的必由之路。利用外源基因表达系统来生产重组果胶酶是大量获得果胶酶的主要技术手段之一。目前，人们已经开发了很多表达系统如：杆状病毒表达系统、原核表达系统、酵母表达系统、丝状真菌表达系统、昆虫细胞表达系统、植物表达系统、哺乳动物表达系统等。大肠杆菌的遗传背景清楚，又由于其具有周期短、高效率、易操作、使用安全等特点，成为外源基因的首选表达系统。不少研究者将外源基因构建大肠杆菌表达载体，经转化E.coli在BL21(DE3)进行表达，但得到的都是无活性的包涵体，通过体外合适的条件下溶解、变性、复性、纯化，从每升培养基可得到仅能得到几十至上百微克的的可溶性蛋白质。在大肠杆菌中表达，可能因为LPS的存在而产生毒副作用，因此往往需要对表达纯化产物的毒性进行分析测定。最后，要得到高纯度的蛋白往往需要经过多步纯化操作处理，纯化的步骤越多，蛋白质的得率就会越低，且更可能导致目标产物的失活，因此该表达系统并不适合于大量生产重组重组果胶酶。昆虫细胞表达系统、植物表达系统、哺乳动物表达系统等外源基因表达系统对技术、设备和技术水平的要求太高，因此生产的产品往往价格都很高，同样不适合果胶酶的大量且低成本地生产。甲醇酵母表达系统是应用最广泛的酵母表达系统，以Pichiapastoris(毕赤巴斯德酵母)为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛。毕赤酵母系统的广泛应用，原因在于该系统除了具有一般酵母所具有的特点外，还具最显著的优点：通过筛选高水平分泌表达的转化子和优化表达条件，可以廉价且大规模地生产和制备重组蛋白。本专利技术经反复优化基因和改变表达载体与菌株，获得了一种人工合成的源自于茯苓的果胶酶基因，该优化的基因可以在毕赤酵母中实现诱导型的高水平表达，利用离子交换能有效纯化该重组酶蛋白，该新型重组果胶酶蛋白能澄清果汁，在果汁的生产加工中具有重要的应用开发价值。
技术实现思路
针对现有技术中的缺陷，本专利技术目的在于提供一种人工合成的新型茯苓果胶酶基因及其重组蛋白的制备方法与应用。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种果胶酶人工序列，所述序列与SEQIDNO.1所示的核苷酸序列的相似度≥90％进一步的改进，所述序列包括SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。进一步的改进，序列为SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。进一步的改进，所述应用为构建重组载体、表达盒或重组菌。进一步的改进，所述SEQIDNO.1所示的核苷酸编码的蛋白质用于果汁澄清。一种果胶酶人工序列的表达方法，包括如下步骤：步骤一、将SEQIDNO.1所示的核苷酸序列重组构建到pPICZα载体中，经转化到毕赤酵母宿主菌细胞中并用1000μg/mLZeocin的YPD平板筛选得到高Zeocin抗性的转化子；步骤二、所得的转化子用BMGY培养基培养至OD600为10～12，离心收集细胞沉淀，用BMMY培养基重悬细胞，加入甲醇并使其质量分数为1～2％，诱导1～3d，筛选高水平分泌表达果胶酶的转化子；步骤三、高水平分泌表达果胶酶的转化子用BMGY大量生长培养，之后用BMMY培养基重悬细胞并在28℃继续诱导培养，补加甲醇使其质量分数保持在1～2％。进一步的改进，还包括步骤四，蛋白纯化：用DEAE离子交换柱对步骤三中BMMY培养基的上清液进行纯化，先用平衡缓冲液平衡层析柱，再将经过透析去除离子并调节pH的上清液过柱，用含30mMNaCl的pH8.0缓冲液漂洗柱子，然后用含100mMNaCl的pH6.0缓冲液溶液将目标蛋白洗脱下来即可。含有上述基因的重组载体、表达盒或重组菌也属于本专利技术的保护范围。所述重组载体具体为将上述基因插入表达载体中，得到表达上述蛋白的重组载体。所述重组载体具体优选为将上述基因插入表达载体pPICZαA的XhoI和XbaI酶切位点间，得到表达上述蛋白的重组载体。扩增所述基因全长或其任意片段的引物对也属于本专利技术的保护范围。上述引物对中的一条引物的核苷酸序列为序列表中的SEQIDNo.3，所述引物对中的另一条引物的核苷酸序列为序列表中的SEQIDNo.4，利用SEQIDNo.3和SEQIDNo.4的引物扩增的目标基因同样可以进行相关的酶切和连接操作。本专利技术还提供一种制备果胶酶蛋白的方法，包括以下步骤：S1：将权利要求1所述的基因和表达载体pPICZαA分别用XhoI和XbaI双酶切并纯化回收，然后利用连接酶在16℃连接，得重组载体pPICZαA-果胶酶；S2：将所述重组载体pPICZαA-果胶酶用SacI单酶切线性化，并用氯化锂转化法转化到毕赤酵母宿主菌中，再经过Zeocin筛选得到阳性克隆；S3：将所述阳性克隆转接至含有1000μg/mLZeocin的YPD平板，筛选得到高Zeocin抗性的转化子，用含有10mlBMGY培养液的50毫升离心管培养高抗性的转化子，28℃、250rpm培养至OD600＝10左右，离心收集菌体并加入1.5ml的BMMY培养基，28℃、250rpm培养2天，每隔12小时向离心管中加入10μl的甲醇，诱导结束后，离心取上清，将上清液40μl加入到10μl的5倍上样缓冲液中，经变性后，利用12％SDS-PAGE进行电泳分析，经染色和脱色后，根据目标蛋白的表达情况，确定最高水平表达重组果胶酶的转化子。S4：将高水平分泌表达果胶酶的转化子用BMGY大量生长培养，之后用BMMY培养基重悬细胞并在28℃继续诱导培养，用于大量分泌果胶酶重组蛋白，并补加甲醇使其质量分数保持在1～2％。进一步，将所述高表达果胶酶的转化子用1L的BMGY培养基扩大培养至OD600为10～15，离心所得菌体用100ml的BMMY培养基重悬后，诱导培养用于大量分泌果胶酶重组蛋白，诱导培养的条件是：28℃、250rpm、每隔24小时向离心管中加入1ml的甲醇，共诱导3-4天。BM本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种果胶酶人工序列，其特征在于，所述序列与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的相似度≥90％。/n

【技术特征摘要】
1.一种果胶酶人工序列，其特征在于，所述序列与SEQIDNO.1所示的核苷酸序列的相似度≥90％。


2.如权利要求1所述的果胶酶人工序列，其特征在于，序列包括SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。


3.如权利要求1所述的果胶酶人工序列，其特征在于，序列为SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。


4.一种权利要求1-3任一所述的果胶酶人工序列的应用，其特征在于，所述应用为构建重组载体、表达盒或重组菌。


5.一种权利要求1-3任一所述的果胶酶人工序列的应用，其特征在于，所述SEQIDNO.1所示的核苷酸编码的蛋白质用于果汁澄清。


6.一种果胶酶人工序列的表达方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、将SEQIDNO.1所示的核苷酸序列重组构建到pPICZα载体中，经转化到毕赤酵母宿主菌细...

【专利技术属性】
技术研发人员：李洪波，董海丽，邓伟思，严盼，张赛名，
申请(专利权)人：怀化学院，
类型：发明
国别省市：湖南;43