具有改善的蛋白A结合作用的Fc区变体制造技术

本文中报道了包含第一多肽和第二多肽的多肽，所述第一多肽和第二多肽各自按N末端至C端方向包含含有一个或多个半胱氨酸残基的至少一部分免疫球蛋白铰链区、免疫球蛋白CH2结构域和免疫球蛋白CH3结构域，其中第一多肽、第二多肽或者第一和第二多肽包含突变Y436A(根据EU索引编号)。

Fc variants with improved protein a binding

【技术实现步骤摘要】
具有改善的蛋白A结合作用的Fc区变体本申请是中国专利申请201580004548.6的分案申请，原申请的申请日是2015年1月12日，专利技术名称是“具有改善的蛋白A结合作用的Fc区变体”。本文中报道了已经就其纯化特性方面修饰的IgGFc区。专利技术背景需要有成本效率的生产过程已经导致优化下游纯化过程(包括一个或多个亲和色谱步骤)的必要性。较大的待加工体积和更严格的就地清洗(CIP)方案要求了需要解决的某些特征(Hober,S.,J.Chrom.B.848(2007)40-47)。借助选择性Fc区亲和配体纯化单克隆抗体是大规模生产治疗性单克隆抗体的最有前景方法学。实际上，这种方法不需要建立与抗体的抗原特异性部分，即Fab结构域的任何相互作用，所述抗原特异性部分因此完整并且可以保留其特性(参见Salvalaglio,M.等人,J.Chrom.A1216(2009)8678-8686)。归因于其选择性，在纯化链中早期使用亲和力-纯化步骤并且因而能减少连续单元操作的数目(参见Hober上文；MacLennan,J.,Biotechnol.13(1995)1180；Harakas,N.K.,BioprocessTechnol.18(1994)259)。采用最多以选择性结合IgG的配体是葡萄球菌蛋白A和蛋白G，它们能够建立与大部分IgG的Fc区在称作"共有结合位点(CBS)”的区域高度选择性相互作用(DeLano,W.L.等人,Science287(2000)1279)，所述共有结合位点位于Fc区的CH2结构域和CH3结构域之间的铰链区处。葡萄球菌蛋白A(SPA)是暴露于革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)表面上的细胞壁缔合的蛋白质结构域。SPA对来自多种物种的IgG例如人、兔和豚鼠IgG具有高亲和力，但是仅与牛IgG和小鼠IgG微弱相互作用(参见下表)(参见Hober上文；Duhamel,R.C.等人,J.Immunol.Methods31(1979)211；L.和Kronvall,G.,Immunol.J.133(1984)969；Richman,D.D.等人,J.Immunol.128(1982)2300；AmershamPharmaciaBiotech,Handbook,AntibodyPurification(2000))。++：强结合/+：中等结合/-：弱或无相互作用IgG的CH2结构域和CH3结构域之间的重链铰链区能够结合除蛋白A之外的几种蛋白质，如新生儿Fc受体(FcRn)(参见DeLano和Salvalaglio，上文)。SPACBS包括抗体表面上的疏水性口袋。组成IgGCBS的残基是Ile253、Ser254、Met252、Met423、Tyr326、His435、Asn434、His433、Arg255和Glu380(根据KabatEU索引编号体系对IgG重链残基编号)。带电荷氨基酸(Arg255、Glu380)位于Ile253和Ser254形成的疏水性结周围。这(能)导致建立极性和亲水性相互作用(参见Salvalaglio上文)。通常而言，蛋白A-IgG相互作用可以使用两个主要结合位点来描述：第一个位点位于重链CH2结构域中并且以(蛋白A的)Phe132、Leu136、Ile150与Ile253和Ser254构成的IgG疏水性结之间的疏水相互作用为特征并且以Lys154(蛋白A)和Thr256(IgG)之间的一个静电相互作用为特征。第二个位点位于重链CH3结构域中并且特征是Gln129和Tyr133(蛋白A)与His433、Asn434和His435(IgG)之间的静电相互作用(参见Salvalaglio上文)。Lindhofer,H.等人(J.Immunol.155(1995)219-225)报道了大鼠/小鼠四合瘤(quadroma)中物种限制的优选性重链/轻链配对。Jedenberg,L.等人(J.Immunol.Meth.201(1997)25-34)报道，两个Fc变体(Fc13和Fc31，各自含有来自另一个相应同种型的同种型二肽置换)的SPA结合作用分析显示Fc1和Fc31与SPA相互作用，而Fc3和Fc13缺少可检测的SPA结合作用。得出以下结论：Fc区变体Fc31所致SPA结合作用因引入的二肽置换R435H和F436Y所致。如今，关于治疗性单克隆抗体的重点在于产生和使用与两种或更多种靶(抗原)特异性结合的双特异性抗体或甚至多特异性抗体。在一个表达细胞系中从四条抗体链(两条不同的重链和两条不同的轻链)产生多特异性异二聚体IgG抗体的基础挑战是所谓的链缔合问题(参见Klein,C.等人,mAbs4(2012)653-663)。要求使用不同链作为多特异性抗体的左臂和右臂导致在一个细胞中表达时抗体混合物：两条重链能够(理论上)按四种不同的组合方式缔合(其中两种相同)，并且这些重链中每一者均可以按随机方式与轻链缔合，产生24(＝总计16)种理论上可能的链组合。16种理论上可能的组合当中，发现存在10种组合，但其中仅一种组合对应于所需功能性双特异性抗体(DeLau,W.B.,等人,J.Immunol.146(1991)906-914)。难以从复杂混合物分离出这种所需的双特异性抗体和理论上最大12.5％的内在不良产率致使在一个表达细胞系中产生双特异性抗体极端富有挑战性。为了克服链缔合问题并且迫使两条不同的重链正确缔合，二十世纪九十年代后期，来自Genentech的Carter等人专利技术了一项方案，称作"结入扣”(KiH)法(参见Carter,P.,J.Immunol.Meth.248(2001)7-15；Merchant,A.M.等人,Nat.Biotechnol.16(1998)677-681；Zhu,Z.等人,Prot.Sci.6(1997)781-788；Ridgway,J.B.等人,Prot.Eng.9(1996)617-621；Atwell,S.等人,J.Mol.Biol.270(1997)26-35；和US7,183,076)。基本上，这个构思依赖于修饰抗体两条重链的两个CH3结构域之间其中发生大部分相互作用的界面。将大体积残基引入一条抗体重链的CH3结构域中并且它类似地充当钥匙("结”)。在另一条重链中，形成能够容纳这个大体积残基的"扣”，从而模拟锁。所得到的异二聚Fc区可以通过引入/形成人工二硫键进一步稳定化。值得注意地，全部KiH突变均埋入CH3结构域内部并且是免疫系统不"可见”的。此外，具有KiH突变的抗体的特性如(热)稳定性、FcγR结合作用和效应子功能(例如，ADCC、FcRn结合作用)和药代动力学(PK)行为不受影响。可以通过引入以下六个突变实现正确的重链缔合，同时异二聚化产率高于97％："结”重链中的S354C、T366W和"扣”重链中的Y349C、T366S、L368A、Y407V(参见Carter上文；根据KabatEU索引编号体系对残基编号)。尽管可能存在扣-扣同型本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多肽，包含/n第一多肽和第二多肽，所述第一多肽和第二多肽各自按N末端至C端方向包含含有一个或多个半胱氨酸残基的至少一部分免疫球蛋白铰链区、免疫球蛋白CH2结构域和免疫球蛋白CH3结构域，/n其中第一多肽、第二多肽或者第一和第二多肽包含突变Y436A(根据EU索引编号)。/n

【技术特征摘要】
20140115 EP 14151322.6;20140425 EP 14165924.31.一种多肽，包含
第一多肽和第二多肽，所述第一多肽和第二多肽各自按N末端至C端方向包含含有一个或多个半胱氨酸残基的至少一部分免疫球蛋白铰链区、免疫球蛋白CH2结构域和免疫球蛋白CH3结构域，
其中第一多肽、第二多肽或者第一和第二多肽包含突变Y436A(根据EU索引编号)。


2.根据权利要求1所述的多肽，特征在于第一和第二多肽包含突变Y436A。


3.根据权利要求1或2所述的多肽，特征在于多肽不与人FcRn特异性结合并且与葡萄球菌蛋白A特异性结合。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽，特征在于
a)第一多肽还包含突变Y349C、T366S、L368A和Y407V并且第二多肽包含突变S354C和T366W，和/或
b)i)第一和第二多肽包含突变H310A、H433A和Y436A，或
ii)第一和第二多肽包含突变L251D、L314D和L432D，或
iii)第一和第二多肽包含突变L251S、L314S和L432S，或
iv)第一多肽包含突变I253A、H310A和H435A并且第二多肽包含突变H310A、H433A和Y436A，或
v)第一多肽包含突变I253A、H310A和H435A并且第二多肽包含突变L251D、L314D和L432D，或
vi)第一多肽包含突变I253A，H310A和H435A并且第二多肽包含突变L251S、L314S和L432S。


5.根据权利要求1至4中任一项所述的多肽，特征在于免疫球蛋白铰链区、免疫球蛋白CH2结构域和免疫球蛋白CH3结构域属于人IgG...

【专利技术属性】
技术研发人员：T·施洛特豪尔，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH