抗VEGF单域抗体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了抗VEGF单域抗体及其应用。具体地，本发明专利技术提供了一种抗VEGF单域抗体及其VHH链。本发明专利技术还提供了编码上述单域抗体或其VHH链的编码序列、相应的表达载体和能够表达该单域抗体的宿主细胞，以及本发明专利技术单域抗体的生产方法。本发明专利技术单域抗体能够特异性识别人VEGFA，不与VEGFB、VEGFC、VEGFD发生交叉反应，具有良好的特异性；本发明专利技术单域抗体能同时识别人、鼠、兔、猴子的VEGFA，能够有效阻断VEGFA与VEGFR2、VEGFA与VEGFR1的相互作用；且对新生血管生成有极好的抑制作用。本发明专利技术单域抗体生成简便。

Anti VEGF single domain antibody and its application

The invention provides an anti VEGF single domain antibody and an application thereof. In particular, the invention provides an anti VEGF single domain antibody and a VHH chain thereof. The invention also provides a coding sequence encoding the single domain antibody or its VHH chain, a corresponding expression vector and a host cell capable of expressing the single domain antibody, and a production method of the single domain antibody of the invention. The single domain antibody of the invention can specifically recognize other VEGFA without cross reaction with vegfb, VEGFC and vegfd, and has good specificity; the single domain antibody of the invention can recognize VEGFA of human, mouse, rabbit and monkey at the same time, can effectively block the interaction between VEGFA and VEGFR2, VEGFA and VEGFR1, and has excellent inhibition effect on neovascularization. The single domain antibody of the invention is easy to generate.

【技术实现步骤摘要】
抗VEGF单域抗体及其应用
本专利技术涉及生物医学或生物制药
，更具体地涉及一种抗VEGF单域抗体及其应用。
技术介绍
现有的血管内皮生长因子药物包括贝伐珠单抗(Bevacizumab，商品名为Avastin)、康柏西普(Conbercept)、阿柏西普(Aflibercept)等。2018年2月13日，国家食品药品监督管理总局(CFDA)已批准艾力雅(阿柏西普眼内注射溶液)用于治疗成人糖尿病性黄斑水肿。用于抗肿瘤治疗的贝伐珠单抗(Bevacizumab，商品名为Avastin)的价格是1998元每瓶4ml(含100mg贝伐珠单抗)，推荐剂量是5mg/kg，每14天给药1次，假如一位患者的体重为60kg，每次应用300mg贝伐珠单抗，也就是三瓶，一个月用药2次，也就是11988元一个月。用于眼科疾病治疗的康柏西普的价格是5550元每支0.2ml(含10mg康柏西普)，它的给药方案是前三月每月注射一次，后续三月注射一次，一年共6次，也就是33300元一年。此外，阿柏西普的价格是5850元每瓶0.1ml(含4mg阿柏西普)，它的给药方案是每两个月给药1次，一年共6次，也就是35100元一年。单域抗体(nanobody，Nb)，即重链单域抗体VHH(variabledomainofheavychainofheavy-chainantibody)—骆驼体内存在着天然缺失轻链的重链抗体(heavy-chainantibody，HCAb)，克隆其可变区而得到的只由一个重链可变区组成的单域抗体，是目前可以得到的具有完整功能的稳定的可结合抗原的最小单位。单域抗体具有稳定性高、水溶性好、人源化简单、靶向性高、穿透性强等特点，在免疫实验、诊断与治疗中，发挥着超乎想象的巨大功能。单域抗体正逐渐成为新一代抗体诊断及治疗中的新兴力量。开发一种新型抗VEGF单域抗体，使其具有较好的特异性、阻断活性，更佳的临床药效，并且生产简便，能够降低生产成本，减轻患者用药负担，已经成为亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新型抗VEGF单域抗体及其应用。具体地，本专利技术的目的在于提供一种能够有效阻断VEGFA与VEGFR2、VEGFA与VEGFR1的相互作用、对新生血管生成有良好的抑制作用，对实体瘤具有良好的抑制作用，且具有较好的特异性的单域抗体。本专利技术的第一方面，提供了一种抗VEGF单域抗体单域抗体VHH链的互补决定区CDR区，所述VHH链的互补决定区CDR包括SEQIDNO.:1所示的CDR1、SEQIDNO.:2所示的CDR2、和SEQIDNO.:3所示的CDR3。在另一优选例中，所述的CDR1、CDR2和CDR3被框架区FR1、FR2、FR3和FR4所隔开。本专利技术的第二方面，提供了一种抗VEGF单域抗体的VHH链，所述的VHH链包括框架区FR和本专利技术的第一方面所述的互补决定区CDR。在另一优选例中，所述的框架区FR包括：(a)SEQIDNO.:4所示的FR1、SEQIDNO.:5所示的FR2、SEQIDNO.:6所示的FR3、和SEQIDNO.:7所示的FR4；或(b)SEQIDNO.:10所示的FR1、SEQIDNO.:11所示的FR2、SEQIDNO.:12所示的FR3、和SEQIDNO.:13所示的FR4。在另一优选例中，所述的抗VEGF单域抗体的VHH链如SEQIDNO.:8或14所示。此外，还提供一种新型抗VEGF单域抗体的重链可变区，所述的重链可变区包括SEQIDNO.:1所示的CDR1、SEQIDNO.:2所示的CDR2、和SEQIDNO.:3所示的CDR3。本专利技术的第三方面，提供了一种抗VEGF单域抗体，它是针对VEGF表位的单域抗体，并且具有本专利技术的第二方面所述的VHH链。在另一优选例中，所述抗VEGF单域抗体包括单体、二价体(二价抗体)、和/或多价体(多价抗体)。在另一优选例中，所述抗VEGF单域抗体包括一条或多条具有如SEQIDNO.:8或SEQIDNO.:14所示的氨基酸序列的VHH链。在另一优选例中，所述抗VEGF单域抗体的VHH链序列如SEQIDNO.:8和/或SEQIDNO.:14所示。在另一优选例中，所述抗VEGF单域抗体包括两条具有如SEQIDNO.:8或SEQIDNO.:14中所示的氨基酸序列的VHH链。在另一优选例中，所述抗VEGF单域抗体具有如SEQIDNO.8和/或SEQIDNO.14中所示的氨基酸序列的VHH链。在另一优选例中，所述两条具有如SEQIDNO.14中所示的氨基酸序列的VHH链之间通过连接子进行连接。在本专利技术的一个优选例中，所述连接子选自以下序列：(GaSb)x—(GmSn)y，其中a，b，m，n，x，y＝0或1或2或3或4或5或6或7或8或9或10(较佳地，a＝4而b＝1，m＝3而n＝1)。在本专利技术的一个优选例中，所述连接子选自下组：GGGGSGGGS(SEQIDNO.18)、GS(SEQIDNO.19)、GGGGS(SEQIDNO.20)。在另一优选例中，所述抗VEGF单域抗体的氨基酸序列如SEQIDNO.16所示。在本专利技术的一个优选例中，所述二价抗VEGF单域抗体为hubi-Nb24(Y)。本专利技术的第四方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码选自下组的蛋白质：本专利技术的第一方面所述的抗VEGF单域抗体VHH链的CDR区、本专利技术的第二方面所述的抗VEGF单域抗体的VHH链、或本专利技术的第三方面所述的抗VEGF单域抗体。在另一优选例中，所述多核苷酸具有如SEQIDNO.:9或15所示的核苷酸序列。在另一优选例中，所述多核苷酸具有如SEQIDNO.17所示的核苷酸序列。在另一优选例中，所述的多核苷酸包括DNA或RNA。本专利技术的第五方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有本专利技术第四方面所述的多核苷酸。在另一优选例中，所述的表达载体选自下组：DNA、RNA、病毒载体、质粒、转座子、其他基因转移系统、或其组合。优选地，所述表达载体包括病毒载体，如慢病毒、腺病毒、AAV病毒、逆转录病毒、或其组合。本专利技术的第六方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本专利技术的第五方面所述的表达载体，或其基因组中整合有本专利技术的第四方面所述的多核苷酸。在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞、噬菌体、或其组合。在另一优选例中，所述原核细胞选自下组：大肠杆菌、枯草杆菌、乳酸菌、链霉菌、奇异变形菌、或其组合。在另一优选例中，所述真核细胞选自下组：巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、裂殖酵母、木霉、或其组合。在另一优选例中，所示真核细胞选自下组：草地粘虫等昆虫细胞、烟草等植物细胞、BHK细胞、CHO细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞、或其组合。在另一优选例中，所述宿主细胞优本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗VEGF单域抗体VHH链的互补决定区CDR区，其特征在于，所述VHH链的互补决定区CDR包括SEQ ID NO.:1所示的CDR1、SEQ ID NO.:2所示的CDR2、和SEQ ID NO.:3所示的CDR3。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗VEGF单域抗体VHH链的互补决定区CDR区，其特征在于，所述VHH链的互补决定区CDR包括SEQIDNO.:1所示的CDR1、SEQIDNO.:2所示的CDR2、和SEQIDNO.:3所示的CDR3。


2.一种抗VEGF单域抗体的VHH链，其特征在于，所述的VHH链包括框架区FR和权利要求1所述的互补决定区CDR，优选地，所述的框架区FR包括：
(a)SEQIDNO.:4所示的FR1、SEQIDNO.:5所示的FR2、SEQIDNO.:6所示的FR3、和SEQIDNO.:7所示的FR4；或
(b)SEQIDNO.:10所示的FR1、SEQIDNO.:11所示的FR2、SEQIDNO.:12所示的FR3、和SEQIDNO.:13所示的FR4。


3.一种抗VEGF单域抗体，其特征在于，它是针对VEGF表位的单域抗体，并且具有权利要求2所述的VHH链。


4.如权利要求3所述的抗VEGF单域抗体，其特征在于，所述单域抗体包含一条或多条具有如SEQIDNO.:8或SEQIDNO.:14所示的氨基酸序列的VHH链。


5.如权利要求3所述的抗VEGF单域抗体，其特征在于，所述抗VEGF单域抗体的氨基酸序列如SEQIDNO.1...

【专利技术属性】
技术研发人员：万亚坤，朱敏，盖军伟，沈晓宁，
申请(专利权)人：上海洛启生物医药技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31