一种重组变形假单胞菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种重组变形假单胞菌及其构建方法和应用，涉及生物工程技术领域，利用重叠PCR、无痕敲除和同源重组技术，构建假单胞菌的gndL(gndC或gndS)和2kgdH的双敲除菌株，阻断其葡萄糖代谢过程中葡萄糖或葡萄糖酸向2‑酮基葡萄糖酸的转化，然后利用该菌株转化葡萄糖为葡萄糖酸。在本发明专利技术实施例中，将变形假单胞菌JSU01ΔgndLΔ2kgdH的种子培养液接种于发酵培养基中，发酵20h后，变形假单胞菌JSU01ΔgndLΔ2kgdH的发酵液中积累的葡萄糖酸为60.04g/L。

A recombinant Pseudomonas Proteus and its construction and Application

【技术实现步骤摘要】
一种重组变形假单胞菌及其构建方法和应用
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种重组变形假单胞菌及其构建方法和应用。
技术介绍
葡萄糖酸是葡萄糖的醛基经氧化生成的一种有机酸，广泛应用于食品、饮料、化工、制药、纺织、洗涤剂、皮革、建筑等行业。文献报道的葡萄糖酸生产方法主要有均相化学氧化法、多相催化氧化法、电解氧化法、酶催化氧化法和生物发酵法等。其中，发酵法是目前最为经济、高效和环境友好的葡萄糖酸的生产方法，在国内外工业生产中得到了普遍采用。在葡萄糖酸的发酵生产中，通常采用的菌种为丝状真菌黑曲霉(Aspergillusniger)，即利用其葡萄糖氧化酶催化氧化葡萄糖为葡萄糖酸内酯，然后水解生成葡萄糖酸。相对于黑曲霉而言，假单胞菌属(Pseudomonas)的细菌具有更好地适应不同理化环境和营养环境、耐受内源性和外源性胁迫的性能。同时，假单胞菌具有高效的葡萄糖胞外氧化系统，在适宜的培养条件下，能够快速、经济地将葡萄糖氧化为葡萄糖酸并进而氧化为2-酮基葡萄糖酸。因此，如能利用代谢工程手段阻断葡萄糖或葡萄糖酸向2-酮基葡萄糖酸的转化，将有可能把假单胞菌改造成为高产葡萄糖酸的工程菌株。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种重组变形假单胞菌及其构建方法和应用，构建假单胞菌的葡萄糖酸脱氢酶结构基因和2-酮基葡萄糖酸脱氢酶基因的双敲除菌株，阻断其葡萄糖代谢过程中葡萄糖或葡萄糖酸向2-酮基葡萄糖酸的转化，可将该菌株应用于葡萄糖向葡萄糖酸的转化生产。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种重组变形假单胞菌，以变形假单胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)JSU01为基础菌株，敲除所述基础菌株的葡萄糖酸脱氢酶结构基因和2-酮基葡萄糖酸脱氢酶基因2kgdH；所述葡萄糖酸脱氢酶结构基因包括gndL、gndC或gndS，所述gndL的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述gndC的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；所述gndS的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述2-酮基葡萄糖酸脱氢酶基因2kgdH的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。本专利技术还提供了所述重组变形假单胞菌的构建方法，包括以下步骤：分别利用重叠PCR、无痕敲除和同源重组的方法敲除所述基础菌株中的所述葡萄糖酸脱氢酶结构基因后，再敲除所述2-酮基葡萄糖酸脱氢酶基因2kgdH。优选的，在敲除所述基础菌株中的所述葡萄糖酸脱氢酶结构基因时所利用的引物，包括L1、L2、L3和L4；所述L1的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，L2的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示，L3的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示，L4的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示。优选的，敲除所述基础菌株中的所述葡萄糖酸脱氢酶结构基因后，还包括对得到的重组菌株JSU01ΔgndL进行验证。优选的，所述验证为以所述重组菌株JSU01ΔgndL的基因组DNA为模板，以L1和L4为引物进行PCR验证。优选的，在敲除所述基础菌株中的所述2-酮基葡萄糖酸脱氢酶基因2kgdH时所利用的引物，包括H1、H2、H3和H4；所述H1的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示，H2的核苷酸序列如SEQIDNO.10所示，H3的核苷酸序列如SEQIDNO.11所示，H4的核苷酸序列如SEQIDNO.12所示。优选的，敲除所述基础菌株中的所述葡萄糖酸脱氢酶结构基因后，还包括对得到的重组菌株JSU01ΔgndLΔ2kgdH进行验证。优选的，所述验证为以所述重组菌株JSU01ΔgndLΔ2kgdH的基因组DNA为模板，以H1和H4为引物进行PCR验证。本专利技术还提供了所述重组变形假单胞菌在发酵生产葡萄糖酸中的应用。优选的，在发酵生产葡萄糖酸时，所利用的发酵培养基包括：140.0g/L淀粉水解糖、1.0g/L尿素和40.0g/L轻质CaCO3；所述发酵生产的条件，包括：搅拌转速为430r/min、温度为33℃、罐压为0.02MPa和通气量为42.0L/min。本专利技术提供了一种重组变形假单胞菌，利用重叠PCR、无痕敲除和同源重组技术，构建假单胞菌的葡萄糖酸脱氢酶结构基因gndL(gndC或gndS)和2-酮基葡萄糖酸脱氢酶基因2kgdH的双敲除菌株，阻断其葡萄糖代谢过程中葡萄糖或葡萄糖酸向2-酮基葡萄糖酸的转化，然后利用该菌株转化葡萄糖为葡萄糖酸。在本专利技术实施例中，利用相同的接种量，分解将变形假单胞菌JSU01ΔgndLΔ2kgdH、JSU01ΔgndL、JSU01Δ2kgdH和JSU01的种子培养液接种于相同的发酵培养基中，在相同的条件下发酵20h，除JSU01ΔgndLΔ2kgdH发酵液中不能检测到2-酮基葡萄糖酸外，其余菌株的发酵液中都能检测到大量的2-酮基葡萄糖酸的存在，而JSU01ΔgndLΔ2kgdH的发酵液中积累了大量的葡萄糖酸。生物保藏信息变形假单胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)JSU01，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，具体地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏时间为2013年1月18日，保藏编号为CGMCCNo.7150。附图说明图1为PCR扩增的变形假单胞菌gndL基因左右同源臂的琼脂糖凝胶电泳分析图；图2为重叠PCR扩增的基因缺失片段ΔgndL的琼脂糖凝胶电泳分析图；图3为重组自杀质粒pK18mobsacB-ΔgndL酶切产物的琼脂糖凝胶电泳分析图；图4为变形假单胞菌JSU01ΔgndL的PCR验证图；图5为PCR扩增的变形假单胞菌2kgdH基因左右同源臂的琼脂糖凝胶电泳分析图；图6为重叠PCR扩增的基因缺失片段Δ2kgdH的琼脂糖凝胶电泳分析图；图7为重组自杀质粒pK18mobsacB-Δ2kgdH酶切产物的琼脂糖凝胶电泳分析图；图8为变形假单胞菌JSU01Δ2kgdH和JSU01ΔgndLΔ2kgdH的PCR验证图；图9为变形假单胞菌JSU01ΔgndLΔ2kgdH、JSU01、JSU01ΔgndL和JSU01Δ2kgdH发酵过程图。具体实施方式本专利技术提供了一种重组变形假单胞菌，以变形假单胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)JSU01为基础菌株，敲除所述基础菌株的葡萄糖酸脱氢酶结构基因和2-酮基葡萄糖酸脱氢酶基因2kgdH；所述葡萄糖酸脱氢酶结构基因包括gndL、gndC或gndS，所述gndL的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示(1788bp)；所述gndC的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示(1314bp)；所述gndS的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示(753bp)；所述2-酮基葡萄糖酸脱氢酶基因2kgdH的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示(1317bp)。本专利技术所述JSU01已进行保藏，保藏编号为CGMCCNo.7本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组变形假单胞菌，其特征在于，以变形假单胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)JSU01为基础菌株，敲除所述基础菌株的葡萄糖酸脱氢酶结构基因和2-酮基葡萄糖酸脱氢酶基因2kgdH；/n所述葡萄糖酸脱氢酶结构基因包括gndL、gndC或gndS，所述gndL的核苷酸序列如SEQID NO.1所示；所述gndC的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述gndS的核苷酸序列如SEQID NO.3所示；/n所述2-酮基葡萄糖酸脱氢酶基因2kgdH的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组变形假单胞菌，其特征在于，以变形假单胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)JSU01为基础菌株，敲除所述基础菌株的葡萄糖酸脱氢酶结构基因和2-酮基葡萄糖酸脱氢酶基因2kgdH；
所述葡萄糖酸脱氢酶结构基因包括gndL、gndC或gndS，所述gndL的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述gndC的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；所述gndS的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；
所述2-酮基葡萄糖酸脱氢酶基因2kgdH的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。


2.权利要求1所述重组变形假单胞菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：分别利用重叠PCR、无痕敲除和同源重组的方法敲除所述基础菌株中的所述葡萄糖酸脱氢酶结构基因后，再敲除所述2-酮基葡萄糖酸脱氢酶基因2kgdH。


3.根据权利要求2所述构建方法，其特征在于，在敲除所述基础菌株中的所述葡萄糖酸脱氢酶结构基因时所利用的引物，包括L1、L2、L3和L4；所述L1的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，L2的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示，L3的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示，L4的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示。


4.根据权利要求2或3所述构建方法，其特征在于，敲除所述基础菌株中的所述葡萄糖酸脱氢酶结构基因后，还包括对得到的重组菌株JSU01ΔgndL进行验证。
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【专利技术属性】
技术研发人员：孙文敬，周强，崔凤杰，余泗莲，昝新艺，王大明，齐向辉，
申请(专利权)人：江西省德兴市百勤异VC钠有限公司，江苏大学，
类型：发明
国别省市：江西;36