一种蛋白质因子RRF编码基因及其在N-乙酰氨基葡萄糖生产中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种生产N‑乙酰氨基葡萄糖的重组谷氨酸棒杆菌及其应用，属于代谢工程领域。该重组谷氨酸棒杆菌通过在谷氨酸棒杆菌中过表达自身来源的核糖体循环因子RRF得到。本发明专利技术的重组谷氨酸棒杆菌提高了乙酰氨基葡萄糖的产量，产量达到26.9g/L，为进一步代谢工程改造谷氨酸棒杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种蛋白质因子RRF编码基因及其在N-乙酰氨基葡萄糖生产中的应用
本专利技术涉及代谢工程领域，尤其涉及一种一种蛋白质因子RRF编码基因及其在N-乙酰氨基葡萄糖生产中的应用。
技术介绍
N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)是氨基葡萄糖的一种衍生物，具有还原性，也是合成双岐因子和透明质酸的重要前体物质，又称2-(乙酰氨基)-2-脱氧-葡萄糖及N-乙酰葡萄糖胺，是生物体内多种多糖的基本组成单位，在生物体内具有重要的生理功能。谷氨酸棒杆菌是放线菌门中高GC含量的革兰氏阳性土壤细菌，已被用于氨基酸的工业生产，并被设计用于生产各种化合物，包括聚合物结构单元和生物燃料。自其基因组序列首次发表以来，其多功能代谢途径及其遗传成分和调控机制已得到广泛研究。为了提高生物技术生产的效率，基于基因组序列信息开发了遗传工具和基于组学的分析方法，包括转录组学，蛋白质组学，代谢组学和流变学，并广泛用于了解代谢途径及其在转录后的调控。在以往的研究中，相对于基因调控的探索往往在转录水平，经过理论体系不断的优化、研究的深入，逐渐对翻译过程也重视起来。经过不断摸索研究，己经发现多种不同的蛋白因子参与了原核细胞翻译起始延长以及终止的进程。其中一个很重要的蛋白质是核糖体循环因子RRF(ribosomerecyclingfactor)，它可以促进终止核糖体复合物拆开，从而使得翻译过程结束，RRF表达的增多会促进生长后期的蛋白合成以及部分代谢产物的增加。文献“代谢工程改造谷氨酸棒状杆菌生产L-异亮氨酸，2015年，赵建勋”公开了RRF促进谷氨酸棒状杆菌L-异亮氨酸合成，同时申请号为201410726700.9的中国专利公开了一株产L-异亮氨酸基因工程菌的构建方法及应用，其公开了扩增基因fusA，frr，ilvBN，ilvA，ppnk以提高谷氨酸棒状杆菌L-异亮氨酸产量。但上述文献均未公开过表达RRF可提高谷氨酸棒状杆菌中N-乙酰氨基葡萄糖产量。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种一种蛋白质因子RRF编码基因及其在N-乙酰氨基葡萄糖生产中的应用，本专利技术通过在谷氨酸棒杆菌中过表达frr基因，从而过表达核糖体循环因子RRF，而得到了N-乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组谷氨酸棒杆菌。本专利技术的技术方案如下：本专利技术的一种产N-乙酰氨基葡萄糖的重组谷氨酸棒杆菌，该重组谷氨酸棒杆菌通过在出发菌谷氨酸棒杆菌中过表达自身来源的核糖体循环因子RRF得到。进一步地，出发菌谷氨酸棒杆菌敲除了乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶编码基因NagA、乙酰氨基葡萄糖脱氨基酶编码基因GamA及L-乳酸脱氢酶的编码基因ldh。进一步地，出发菌谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌C.glutamicumS9114ΔnagA-ΔgamA-Δldh。谷氨酸棒杆菌C.glutamicumS9114ΔnagA-ΔgamA-Δldh是以谷氨酸棒杆菌C.glutamicumS9114ΔnagA-ΔgamA为出发菌株，在其基础上敲除了L-乳酸脱氢酶的编码基因ldh得到。其中，L-乳酸脱氢酶的编码基因ldh如NCBI-GeneID:1020853所示。谷氨酸棒杆菌C.glutamicumS9114ΔnagA-ΔgamA的构建方法参照CN110195036A。通过敲除编码催化由丙酮酸形成乳酸的L-乳酸脱氢酶的ldh基因，来阻断宿主菌谷氨酸棒杆菌合成副产物乳酸的途径。进一步地，核糖体循环因子RRF的编码基因为frr，frr的基因序列如NCBI-GeneID:1019979所示，其核苷酸序列如SEQIDNO.8所示，frr基因所编码的氨基酸序列如SEQIDNO.9所示。frr基因编码的RRF是一种核糖体循环因子，在原核生物翻译终止阶段促进核糖体复合物拆开，并可以有效避免整个翻译过程中产生错误的多功能蛋白。通过将frr基因与GlcNAc合成途径的关键基因GNA1以及glmS共表达，促进了对应的酶氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰转移酶以及氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的表达，从而提高了谷氨酸棒杆菌生产GlcNAc的能力。进一步地，核糖体循环因子RRF的编码基因通过表达载体pJYW-4-ceN-C.glglmS表达。表达载体pJYW-4-ceN-C.glglmS具体构建过程参见文献——ChenDeng,XueqinLv,YanfengLiu,LongLiu.MetabolicengineeringofCorynebacteriumglutamicumS9114basedonwhole-genomesequencingforefficientN-acetylglucosaminesynthesis.SyntheticandSystemsBiotechnology,2019.4:120-129。本专利技术还提供了一种上述产N-乙酰氨基葡萄糖的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，包括以下步骤：将pJYW-4-ceN-C.glglmS-frr表达载体转入宿主菌，得到所述产N-乙酰氨基葡萄糖的重组谷氨酸棒杆菌。进一步地，宿主菌为敲除了乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶编码基因NagA、乙酰氨基葡萄糖脱氨基酶编码基因GamA和L-乳酸脱氢酶的编码基因ldh的谷氨酸棒杆菌。进一步地，宿主菌为谷氨酸棒杆菌C.glutamicumS9114ΔnagA-ΔgamA-Δldh，其构建方法包括以下步骤：利用乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶编码基因NagA的基因敲除框、乙酰氨基葡萄糖脱氨基酶编码基因GamA的基因敲除框和L-乳酸脱氢酶的编码基因ldh的基因敲除框依次敲除谷氨酸棒杆菌C.glutamicumS9114中的乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶编码基因NagA、乙酰氨基葡萄糖脱氨基酶编码基因GamA及L-乳酸脱氢酶的编码基因ldh。谷氨酸棒杆菌C.glutamicumS9114ΔnagA-ΔgamA-Δldh是以谷氨酸棒杆菌C.glutamicumS9114ΔnagA-ΔgamA为出发菌株，在其基础上敲除了L-乳酸脱氢酶的编码基因ldh得到。谷氨酸棒杆菌C.glutamicumS9114ΔnagA-ΔgamA的构建方法参照CN110195036A。在此基础上，继续构建L-乳酸脱氢酶的编码基因ldh的基因敲除框，经同源重组，用ldh的基因敲除框中的卡那霉素抗性基因kana代替组谷氨酸棒杆菌C.glutamicumS9114ΔnagA-ΔgamA基因组中的L-乳酸脱氢酶编码基因ldh。更具体地，pJYW-4-ceN-C.glglmS-frr表达载体pJYW-4-ceN-C.glglmS-RRF的构建方法，步骤如下：(1)按照S9114基因组设计扩增引物扩增RRF上游引物FragmentRRF.FOR：5’——ACCGTCGAATAATATAAACAGCGTGGCTTATCTAGGTTCG——3’；下游引物FragmentRRF.REV：5’——CCTTTGCTAGTCTAGACCTCCATCAGTTCCTTTTCCT——3’；同时设计载体pJYW-4-ceN-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产N-乙酰氨基葡萄糖的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于：所述重组谷氨酸棒杆菌通过在谷氨酸棒杆菌中过表达自身来源的核糖体循环因子RRF得到。/n

【技术特征摘要】
1.一种产N-乙酰氨基葡萄糖的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于：所述重组谷氨酸棒杆菌通过在谷氨酸棒杆菌中过表达自身来源的核糖体循环因子RRF得到。


2.根据权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于：所述谷氨酸棒杆菌敲除了乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶编码基因NagA、乙酰氨基葡萄糖脱氨基酶编码基因GamA及L-乳酸脱氢酶的编码基因ldh。


3.根据权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于：所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌C.glutamicumS9114ΔnagA-ΔgamA-Δldh。


4.根据权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于：所述核糖体循环因子RRF的编码基因为frr，frr的基因序列如NCBI-GeneID:1019979所示。


5.根据权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于：所述核糖体循环因子RRF的编码基因通过表达载体pJYW-4-ceN-C.glglmS表达。


6.一种权利要求1-5中任一项所述的产N-乙酰氨基葡萄糖的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
将pJYW-4-ceN-C...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘龙，邓琛，卢健行，刘长峰，卢建功，李江华，堵国成，陈坚，
申请(专利权)人：江南大学，山东润德生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32