一种变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸差向异构酶缺失突变株及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种变形假单胞菌2

【技术实现步骤摘要】
一种变形假单胞菌2
‑
酮基葡萄糖酸差向异构酶缺失突变株及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种变形假单胞菌2
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酮基葡萄糖酸差向异构酶缺失突变株及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]2‑
酮基葡萄糖酸(2
‑
ketogluconic acid,2KGA)又称2
‑
酮基
‑
D
‑
葡萄糖酸(2
‑
keto
‑
D
‑
gluconic acid)，目前主要用作生产食品添加剂D
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异抗坏血酸及其盐类的前体，也可作为杂环化合物合成、区域选择性和立体选择性化学反应中的基础材料。
[0003]发酵法是目前最为经济、高效、环境友好的2KGA工业生产方法。2KGA发酵通常利用假单胞菌(Pseudomonas)、葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter)、欧文氏菌(Erwinia)、醋酸杆菌(Acetobacter)或沙雷氏菌(Serratia)，其中在国际上得到普遍使用的为假单胞菌。变形假单胞菌(P.plecoglossicida)JSU01是一株能够在高浓度葡萄糖存在的条件下迅速生长、高效合成2KGA菌株，是迄今为止国际上报道的2KGA合成效率最高的菌株之一，已成为我国2KGA发酵生产的主要工业用菌。目前，变形假单胞菌JSU01已于2013年1月18日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心中，保藏编号为CGMCC No.7150。
[0004]假单胞菌利用葡萄糖作为碳源时，2KGA的合成与分解代谢过程是同时存在的，即在2KGA发酵过程中，2KGA既是发酵目的产物，也是可被其生产菌株利用的中间代谢产物。这种现象的存在，客观上不利于提高2KGA发酵生产的经济性，同时也给其发酵生产过程控制带来了一些不确定的因素。因此，如何有效降低发酵液中的2KGA被转运至胞内进而被代谢利用成为进一步提升2KGA发酵水平的技术难题。
[0005]在假单胞菌中，与2KGA分解代谢相关的基因位于染色体上的2KGA利用操纵子(kgu操纵子)中。kgu操纵子的结构基因包括kguT、kguK、kguE和kguD，分别编码2
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酮基葡萄糖酸转运蛋白(KguT)、2
‑
酮基葡萄糖酸激酶(KguK)、2
‑
酮基葡萄糖酸差向异构酶(KguE)和2
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酮基
‑6‑
磷酸葡萄糖酸还原酶(KguD)。其中：KguT是一种跨膜转运蛋白，能够将周质空间或培养环境中的2KGA转运至细胞质中；KguK是一种ATP依赖性激酶，在ATP存在的条件下能够将2KGA磷酸化为2
‑
酮基
‑6‑
磷酸葡萄糖酸；KguD是一种NADPH依赖性还原酶，能够将2
‑
酮基
‑6‑
磷酸葡萄糖酸还原为中心代谢产物6
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磷酸葡萄糖酸。KguE是一种与假单胞菌2KGA分解代谢相关的异构酶，但到目前为止，KguE在2KGA代谢中的作用尚未得到明确的阐释。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种变形假单胞菌2
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酮基葡萄糖酸差向异构酶缺失突变株(JSU01ΔkguE)，减少假单胞菌2KGA发酵过程中2KGA的分解代谢，具有更为优良的2KGA发酵生产性能。
[0007]本专利技术的目的还在于提供变形假单胞菌2
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酮基葡萄糖酸差向异构酶缺失突变株在2KGA发酵生产中的应用，有利于减少假单胞菌2KGA发酵过程中2KGA的分解代谢，从而提
高2KGA的产量。
[0008]本专利技术提供了一种变形假单胞菌2
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酮基葡萄糖酸差向异构酶缺失突变株JSU01ΔkguE，以变形假单胞菌JSU01为基础菌株，敲除2
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酮基葡萄糖酸差向异构酶的全部编码序列或部分编码序列。
[0009]优选的，敲除的2
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酮基葡萄糖酸差向异构酶的全部编码序列如SEQ ID NO:1所示。
[0010]优选的，敲除的2
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酮基葡萄糖酸差向异构酶的部分编码序列如SEQ ID NO:2所示。
[0011]本专利技术提供了所述变形假单胞菌2
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酮基葡萄糖酸差向异构酶缺失突变株JSU01ΔkguE的构建方法，包括以下步骤：
[0012]1)以变形假单胞菌JSU01的基因组DNA为模板，用引物P1、引物P2进行PCR扩增，得到kguE基因的上游同源臂片段；
[0013]2)以变形假单胞菌JSU01的基因组DNA为模板，用引物P3、引物P4进行PCR扩增，得到kguE基因的下游同源臂片段；
[0014]3)以步骤1)中所述kguE基因的上游同源臂片段和步骤2)中所述kguE基因的下游同源臂片段为模板，用引物P1和P4进行重叠PCR扩增，得到融合片段ΔkguE；
[0015]4)将所述融合片段ΔkguE和质粒用BamH I和Hind III进行双酶切处理，得到双酶切产物进行连接，得到携带融合片段ΔkguE的重组载体；
[0016]5)将步骤4)中所述携带融合片段ΔkguE的重组载体转化到变形假单胞菌JSU01的感受态细胞中，得到重组菌株JSU01ΔkguE；
[0017]其中步骤1)与步骤2)之间没有时间顺序的限制。
[0018]优选的，步骤1)中引物P1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；引物P2的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0019]优选的，步骤2)中引物P3的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；引物P4的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
[0020]优选的，步骤5)中转化后，包括阳性菌株的筛选；
[0021]所述阳性菌株的筛选的方法是以转化后的菌株的基因组DNA为模板，采用引物P1和P4进行PCR扩增，PCR扩增产物为1594bp时表明转化后的菌株为缺失kguE基因的突变株JSU01ΔkguE。
[0022]本专利技术提供了所述变形假单胞菌2
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酮基葡萄糖酸差向异构酶缺失突变株JSU01ΔkguE或所述构建方法构建得到的JSU01ΔkguE在2KGA发酵生产中的应用。
[0023]本专利技术提供了所述变形假单胞菌2
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酮基葡萄糖酸差向异构酶缺失突变株JSU01ΔkguE或所述构建方法构建得到的JSU01ΔkguE在制备生产2KGA的发酵剂中的应用。
[0024]本专利技术提供了一种生产2KGA的发酵剂，包括所述变形假单胞菌2
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酮基葡萄糖酸差向异构酶缺失突变株JSU01ΔkguE或所述构建方法构建得到的JSU01ΔkguE。
[0025]本专利技术提供了一种变形假单胞菌2
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种变形假单胞菌2
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酮基葡萄糖酸差向异构酶缺失突变株JSU01ΔkguE，其特征在于，以变形假单胞菌JSU01为基础菌株，敲除2
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酮基葡萄糖酸差向异构酶的全部编码序列或部分编码序列。2.根据权利要求1所述变形假单胞菌2
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酮基葡萄糖酸差向异构酶缺失突变株JSU01ΔkguE，其特征在于，敲除的2
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酮基葡萄糖酸差向异构酶的全部编码序列如SEQ ID NO:1所示。3.根据权利要求1所述变形假单胞菌2
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酮基葡萄糖酸差向异构酶缺失突变株JSU01ΔkguE，其特征在于，敲除的2
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酮基葡萄糖酸差向异构酶的部分编码序列如SEQ ID NO:2所示。4.权利要求1～3任意一项所述变形假单胞菌2
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酮基葡萄糖酸差向异构酶缺失突变株JSU01ΔkguE的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)以变形假单胞菌JSU01的基因组DNA为模板，用引物P1、引物P2进行PCR扩增，得到kguE基因的上游同源臂片段；2)以变形假单胞菌JSU01的基因组DNA为模板，用引物P3、引物P4进行PCR扩增，得到kguE基因的下游同源臂片段；3)以步骤1)中所述kguE基因的上游同源臂片段和步骤2)中所述kguE基因的下游同源臂片段为模板，用引物P1和P4进行重叠PCR扩增，得到融合片段ΔkguE；4)将所述融合片段ΔkguE和质粒用BamH I和Hind III进行双酶切处理，得到双酶切产物进行连接，得到携带融合片段ΔkguE的重组载体；5)将步骤4)中所述携带融合片...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙文敬，王家皓，孙雷，周强，崔凤杰，余泗莲，王大明，昝新艺，齐向辉，
申请(专利权)人：江西省德兴市百勤异VC钠有限公司，
类型：发明
国别省市：