一种无标记猪β-防御素2基因定点敲入质粒载体及其应用制造技术

本发明专利技术属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种无标记猪β‑防御素2基因定点敲入质粒载体及其应用。本发明专利技术与转基因动物领域相关。构建了能表达双拷贝pbd‑2基因的供体质粒pcCAG‑R26‑PBD2‑T2A‑PBD2，该供体质粒还含有双侧带有loxP序列的新霉素抗性基因neoR表达盒。试验证明，将该质粒与能同时表达Cas9蛋白与靶向猪Rosa26位点的向导RNA的打靶质粒pX330‑pRosa26同时电转入受体细胞，实现了pbd‑2基因定点整合入猪的Rosa26位点，并通过Cre重组酶删除了抗性标记，经体细胞核移植及胚胎移植能够得到无抗性标记的pbd‑2基因定点敲入猪。

A site-specific plasmid vector of porcine \u03b2 - defensin 2 gene and its application

【技术实现步骤摘要】
一种无标记猪β-防御素2基因定点敲入质粒载体及其应用
本专利技术属于转基因动物基因工程
，具体涉及过表达猪β-防御素2(pbd-2)基因的定点敲入供体质粒pcCAG-R26-PBD2-T2A-PBD2及其构建方法。本专利技术的重组质粒可用于制备无标记pbd-2基因定点敲入细胞系与无标记pbd-2基因定点敲入转基因猪。
技术介绍
防御素是一类阳离子抗菌肽，一般由18-45个氨基酸组成，含有6个半胱氨酸残基，形成3个分子内二硫键。在脊椎动物中，根据空间结构及二硫键结合能力，防御素被分为α、β和θ三大类。到目前为止，研究表明猪体内仅存在β防御素。通过与已知的猪β防御素-1进行序列比对，猪β-防御素2(PBD-2)于2006年首次被发现(Sangetal.2006)，被证实广泛分布于猪的心、肝、脾、肺、肾、小肠和大肠等各个组织中(Baoetal.2015)。体外杀菌实验证明PBD-2对鼠伤寒沙门氏菌、李斯特菌、葡萄球菌、大肠杆菌、猪链球菌和猪红斑丹毒丝菌等数种猪病原菌均有显著抑制作用(Pengetal.2014；Veldhuizeneta本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种适用于培育无标记pbd-2基因定点敲入猪的载体pcCAG-R26-PBD2-T2A-PBD2，其特征在于，该载体通过以下步骤制备获得：/n(1)以SEQ ID NO：1所示序列的起始载体pcCAG-PBD2为材料，用EcoRI和XhoI双酶切，切除该载体中登录号为NW_018085039.1的pbd-2基因；/n(2)以SEQ ID NO：1所示序列的起始载体pcCAG-PBD2为材料，通过延伸PCR扩增出5’端添加EcoRI酶切位点与Kozak sequence且3’端添加BamHI酶切位点的pbd-2基因，同时扩增5’端添加BamHI酶切位点与T2A序列且3’端添加XhoI酶切位点...

【技术特征摘要】
1.一种适用于培育无标记pbd-2基因定点敲入猪的载体pcCAG-R26-PBD2-T2A-PBD2，其特征在于，该载体通过以下步骤制备获得：
(1)以SEQIDNO：1所示序列的起始载体pcCAG-PBD2为材料，用EcoRI和XhoI双酶切，切除该载体中登录号为NW_018085039.1的pbd-2基因；
(2)以SEQIDNO：1所示序列的起始载体pcCAG-PBD2为材料，通过延伸PCR扩增出5’端添加EcoRI酶切位点与Kozaksequence且3’端添加BamHI酶切位点的pbd-2基因，同时扩增5’端添加BamHI酶切位点与T2A序列且3’端添加XhoI酶切位点的pbd-2基因，而后将两个pbd-2基因通过BamHI酶切并经T4连接酶连接，将所得的连接产物命名为PBD2-T2A-PBD2，即SEQIDNO：2第1731-2210位所示的碱基序列；
(3)在步骤(1)中EcoRI和XhoI切除载体pbd-2基因的位置，即SEQIDNO：1第1720-1941碱基位置上定向插入步骤(2)中所述的PBD2-T2A-PBD2基因片段，得到如SEQIDNO：2所示序列的中间载体pcCAG-PBD2-T2A-PBD2；
(4)以猪基因组为模板经延伸PCR扩增靶位点右侧同源臂序列，将该序列命名为loxP-RA，即SEQIDNO：3第4495-5300位所示的碱基序列，在该片段同源臂5’端添加SacI酶切位点与loxP序列的3’端添加BstZ17I酶切位点；
(5)以SEQIDNO：1所示的起始载体pcCAG-PBD2为模板经延伸PCR扩增抗性基因，将所得产物命名为loxP-neoR，即SEQIDNO：3第2758-4494位所示的碱基序列，在该片段新霉素抗性基因5’端添加DraIII酶切位点与loxP序列，其3’端添加有SacI酶切位点；
(6)将步骤(4)与步骤(5)所述DNA片段loxP-RA和loxP-neoR用SacI酶切后经T4连接酶连接，将所得的连接产物命名为...

【专利技术属性】
技术研发人员：周锐，黎璐，黄靖，王安田，黄超，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42