提取外泌体的共沉淀剂、试剂组、试剂盒和提取方法技术

本发明专利技术公开了一种提取外泌体的共沉淀剂、试剂组、试剂盒和提取方法，涉及外泌体提取技术领域。本发明专利技术公开的提取外泌体的共沉淀剂含有如下组分：亲水聚合物、无机盐和葡萄糖。采用本发明专利技术提供的试剂组提取外泌体操作简单，不涉及昂贵的精密仪器，普适性更强，同时有效降低了检测的时间和经济成本，有利于市场应用推广，所提取的外泌体含量和纯度较高，所提取的外泌体用于提取核酸和蛋白时，可提取出高质量的核酸和蛋白。

Coprecipitating agent, reagent group, kit and extraction method of exosomes

【技术实现步骤摘要】
提取外泌体的共沉淀剂、试剂组、试剂盒和提取方法
本专利技术涉及外泌体提取
，具体而言，涉及一种提取外泌体的共沉淀剂、试剂组、试剂盒和提取方法。
技术介绍
外泌体是50-150nm的小细胞外囊泡(sEV)，其含有蛋白质、脂质和核酸，并且在各种生理和病理途径中充当细胞-细胞通信的重要介质。目前的研究表明：外泌体在血液、唾液、尿液、腹水、羊水、母乳和脊液等体液中均具有较高的丰度，且其中含有蛋白质、RNA和脂肪成分。外泌体不仅可以保护细胞分泌的RNA稳定存在，还可以保护细胞合成过程中的中间产物，还能够作为有效的载体将RNA转运到特定的靶细胞中，发挥重要的调控作用。多国学者经深入研究发现外泌体还可以运输核酸，参与细胞间通讯，参与细胞间的物质交换和信息交流，影响细胞的生理状态，并与多种疾病的发生与进程密切相关。直接从患者血清等体液标本分离外泌体，并对其内容物进行检测，临床应用前景广阔，因此外泌体及其内容物提取方面的研究和选择有重要的实用意义。目前存在的分离外泌体的方法主要有以下几种：1)利用不同的超速离心速度或者是密度梯度离心。目前该方法被认为是外泌体分离的金标准，用此法分离的外泌体的纯度高，但此法提取出的外泌体RNA含量非常低，且超速离心机价格昂贵无法普及，并且此法提取的外泌体结构域可能被破坏。因此并不适用于大量实际应用推广。2)超滤法，此方法虽然操作简单，但得到的外泌体纯度不高。3)商品化的试剂盒，此种方法，可以分为两类，一类是将抽提试剂加入到样品中，离心得到外泌体的沉淀；另一类是通过层析柱或磁珠等吸附富集。市售试剂盒通常操作简便，但是，对于一些复杂样本，例如尿液、乳汁、细胞上清等，从少量的上述样本中提取的外泌体量过低，无法达到一些大规模筛选或表达检测的实验要求。同时，提取试剂的昂贵使得其在实际中很难推广应用，很大程度限制了这种方法的应用；并且随着外泌体的研究不断深入，仅提取外泌体已无法完全满足研究的需求，为了后续深入研究，需要进一步提取其相关蛋白或核酸，这无疑进一步增加了研究成本。鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种提取外泌体的共沉淀剂、试剂组、试剂盒和提取方法。采用本专利技术提供的共沉淀剂提取外泌体操作简单，不涉及昂贵的精密仪器，普适性更强，同时有效降低了检测的时间和经济成本，有利于市场应用推广，所提取的外泌体含量和纯度较高，所提取的外泌体用于提取核酸和蛋白时，可提取出高质量的核酸和蛋白。本专利技术是这样实现的：第一方面，本专利技术实施例提供一种提取外泌体的共沉淀剂，所述共沉淀剂含有如下组分：亲水聚合物、无机盐和葡萄糖。本专利技术的实施例研究发现，将亲水聚合物、无机盐和葡萄糖混合在同一体系中用于提取外泌体时，利用各组分的相互配合作用，该共沉淀剂可以改变外泌体在样品中的微环境，使其易于在提取环境中沉降，提高外泌体收率，提高外泌体的提取量和纯度；此外，该共沉淀剂的组分简单易获取，可适用于多种类型的体液样品提取或也适用于小体积液体样本中的外泌体提取和检测，提取方法简单，无需特殊设备，避免了超高速离心力对外泌体的伤害，分离得到的外泌体结构完整、其内含物保存完好，适宜对外泌体进一步分离或其内含物分析，例如用于后续的核酸或蛋白提取。无机盐与亲水聚合物的配合作用在于，在适当的浓度或是在一个特定的温度下可形成双水相萃取体系；物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种作用力(如憎水键、氢键和离子键等)的存在和环境因素的影响，使其在上、下相中的浓度不同，适宜提取水溶性的蛋白质、酶、外泌体等生物活性物质，且不易引起蛋白质的变性失活，也不存在有机溶剂残留问题。葡萄糖的作用是增加溶液的粘度，维持渗透压，防止外泌体受机械剪切力作用而降解。在可选的实施方式中，在所述共沉淀剂中，所述亲水聚合物的含量为25％-75％，优选为40％-60％(w/v)，更优选为50％(w/v)。在可选的实施方式中，所述亲水聚合物选自聚乙二醇、葡聚糖和聚乙烯基吡咯烷酮中的任意一种或几种的组合。通过控制亲水聚合物的浓度范围或选用合适类型的亲水聚合物例如聚乙二醇、葡聚糖和聚乙烯基吡咯烷酮，能最大程度地排除底层相中的非外泌体杂质，显著提高外泌体的纯度，可有效降低后续外泌体研究中的假阳性率。在可选的实施方式中，所述亲水聚合物为聚乙二醇。在可选的实施方式中，所述亲水聚合物为聚乙二醇和葡聚糖的组合。在可选的实施方式中，聚乙二醇的分子量为7000-9000。聚乙二醇(PEG)作为环氧乙烷的聚合产物，是一种理想的用于提取外泌体的沉淀剂组分，经本专利技术实施例研究发现，使用低分子量(7000-9000)聚乙二醇，在提取时，生物样本无须进行孵育，便能得到高保真的外泌体，缩短了时间，同时有效提高了提取效率。在可选的实施方式中，聚乙二醇的分子量为8000。本专利技术的研究还发现，使用分子量为8000的聚乙二醇提取得到的外泌体分布较均匀，整体均一性更好，数量也更多。在可选的实施方式中，所述无机盐选自钠盐、钾盐和镁盐中的至少一种。所述无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化镁、葡萄糖酸钠和醋酸钠中的至少一种。在可选的实施方式中，所述无机盐选自NaCl。在可选的实施方式中，在所述共沉淀剂中，NaCl的浓度为0.4-0.6mol/L。在可选的实施方式中，在所述共沉淀剂中，葡萄糖的含量为2％-3％(w/v)。在可选的实施方式中，所述共沉淀剂的溶剂选自PBS或磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。在可选的实施方式中，所述共沉淀剂的pH为6.8-7.4。第二方面，本专利技术实施例提供一种提取外泌体的试剂组，其包括前述实施方式任一项所述的提取外泌体的共沉淀剂以及用于保存外泌体的保存液A。在可选的实施方式中，所述保存液A含有如下组分：硫酸多粘菌素B、硫酸庆大霉素、Tris-HCl、EDTA和蔗糖。硫酸多粘菌素BE和硫酸庆大菌素B配合使用，具有抑菌效果，有效延长外泌体的保存时限，避免其受污染。在可选的实施方式中，在所述保存液A中，硫酸多粘菌素B的含量为0.02-0.04g/L。在可选的实施方式中，在所述保存液A中，酸庆大霉素的含量为0.1-0.2g/L。在可选的实施方式中，所述保存液A的溶剂选自PBS、Tris-HCl缓冲液或巴比妥钠-盐酸缓冲液。在可选的实施方式中，所述保存液A的pH为7.0-7.2。在可选的实施方式中，所述保存液A含有：0.02g/L硫酸多粘霉菌素B、0.2g/L硫酸庆大霉素、0.05mol/LTris-HCl、20mol/LEDTA和28mol/L蔗糖，溶剂为PBS，pH为7.0-7.2。第三方面，本专利技术实施例提供一种提取外泌体的试剂盒，其包括前述实施方式任一项所述的提取外泌体的共沉淀剂或前述实施方式任一项所述的提取外泌体的试剂组。第四方面，本专利技术实施例提供一种外泌体及其核酸和蛋白共提取的试剂盒，其包括前述实施方式任一项所述的提取外泌体的试本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提取外泌体的共沉淀剂，其特征在于，其含有如下组分：亲水聚合物、无机盐和葡萄糖。/n

【技术特征摘要】
1.一种提取外泌体的共沉淀剂，其特征在于，其含有如下组分：亲水聚合物、无机盐和葡萄糖。


2.根据权利要求1所述的共沉淀剂，其特征在于，在所述共沉淀剂中，所述亲水聚合物的含量为25％-75％，优选为40％-60％(w/v)；更优选为50％(w/v)；
优选地，所述亲水聚合物选自聚乙二醇、葡聚糖和聚乙烯基吡咯烷酮中的任意一种或几种的组合；
优选地，所述亲水聚合物为聚乙二醇；
优选地，所述亲水聚合物为聚乙二醇和葡聚糖的组合；
优选地，聚乙二醇的分子量为7000-9000；更优选为8000。


3.根据权利要求2所述的共沉淀剂，其特征在于，所述无机盐选自钠盐、钾盐和镁盐中的至少一种；
优选地，所述无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化镁、葡萄糖酸钠和醋酸钠中的至少一种；
优选地，所述无机盐为氯化钠；
优选地，在所述共沉淀剂中，氯化钠的浓度为0.4-0.6mol/L；
优选地，在所述共沉淀剂中，葡萄糖的含量为2％-3％(w/v)；
优选地，所述共沉淀剂的溶剂选自PBS或磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液；
优选地，所述共沉淀剂的pH为6.8-7.4。


4.一种提取外泌体的试剂组，其特征在于，其含有权利要求1-3任一项所述的共沉淀剂和用于保存外泌体的保存液A；
优选地，所述保存液A含有如下组分：硫酸多粘菌素B、硫酸庆大霉素、Tris-HCl、EDTA和蔗糖；
优选地，在所述保存液A中，硫酸多粘菌素B的含量为0.02-0.04g/L；
优选地，在所述保存液A中，酸庆大霉素的含量为0.1-0.2g/L；
优选地，所述保存液A的溶剂选自PBS、Tris-HCl缓冲液或巴比妥钠-盐酸缓冲液；
优选地，所述保存液A的pH为7.0-7.2。


5.一种提取外泌体的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1-3任一项所述的提取外泌体的共沉淀剂或权利要求4所述的提取外泌体的试剂组。


6.一种外泌体及其核酸和蛋白共提取的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求4所述的提取外泌体的试剂组，以及核酸提取试剂组和蛋白提取试剂组。


7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸提取试剂组包括如下试剂中的至少一种：裂解液、抽提液A、洗脱液A、洗脱液B和...

【专利技术属性】
技术研发人员：许嘉森，陈至里，朱蓉，吴诗扬，刘志明，
申请(专利权)人：益善生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44