监测细胞自噬的溶酶体靶向pH荧光探针及制备和应用制造技术

本发明专利技术涉及pH荧光探针技术领域，具体涉及监测细胞自噬的溶酶体靶向pH荧光探针及制备和应用。其制备方法是：将2‑(2‑氨基乙基)‑3'，6'‑双(二乙氨基)螺环[异吲哚‑1,9'‑黄原]‑3‑酮和2‑(2‑甲氧基乙氧基)4‑甲基苯磺酸乙酯溶于N,N‑二甲基甲酰胺中，加热回流制得粗品；将粗品除去溶剂，经硅胶柱分离得到纯品。通过细胞毒性测试表明本发明专利技术对细胞几乎没有毒副作用，进而通过细胞共定位实验确定该探针能够专一性靶向细胞溶酶体，激光共聚焦显微成像实验表明本发明专利技术的探针具有良好的细胞膜渗透性，并能对溶酶体内pH的变化进行高灵敏检测。本发明专利技术的探针可以通过检测溶酶体内pH的变化来监测细胞的自噬过程。

Preparation and application of lysosomal targeted pH fluorescence probe for monitoring autophagy

【技术实现步骤摘要】
监测细胞自噬的溶酶体靶向pH荧光探针及制备和应用
本专利技术涉及pH荧光探针
，具体涉及监测细胞自噬的溶酶体靶向pH荧光探针及制备和应用。
技术介绍
自噬(autophagy)是由Ashford和Porter在1962年发现细胞内有“自己吃自己”的现象后提出的，是指从粗面内质网的无核糖体附着区脱落的双层膜包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分形成自噬体(autophagosome)，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。细胞自噬作为生物体中一种非常重要的代谢途径，是细胞成分降解和回收利用的基础，在细胞中起着“清道夫”的作用。传统的自噬监测策略是基于扫描电子显微镜(TEM)，通过蛋白免疫印迹(Atg8/LC3)或基因编码的荧光蛋白法(GFP-LC3/p62)监测自噬体相关蛋白。然而，这些方法通常具有局限性，如扫描电镜和蛋白免疫印迹法通常需要进行细胞固定以使细胞易于获得抗体，即无法监测活细胞自噬状态；同时，荧光蛋白法需要复杂的设计和转染过程，不允许长时间的自噬监测，再加上GFP-LC3容易在酸性自噬溶酶体中的降解以及GFP的荧光猝灭等，通过上述方法很难实现对活细胞自噬的快速、实时、低成本的监测。因此以一种高效和经济的方式来观察自噬仍然是一个巨大的挑战。溶酶体是真核细胞中一种具有单层膜结构的细胞器，内含许多水解酶，用来分解多种外源性和内源性生物大分子物质或细胞自身的局部细胞质或细胞器等。一般来说，自噬发生时，自噬体的膜会和溶酶体的膜进行融合形成自噬溶酶体，使内容物在酸性pH值(4.5～5.5)的水解酶的帮助下降解和再循环。在自噬的膜融合过程中，由于溶酶体和自噬体的差异，溶酶体pH值等微环境会发生变化。因此，我们可以通过检测溶酶体内pH的变化来监测自噬进行的程度。目前文献报道了许多检测溶酶体pH变化的荧光探针，然而由于这些探针的激发和发射波长大多处于紫外区域，与细胞自发荧光相互交叠，造成背景荧光较强，且紫外光对细胞的毒副作用较大，因而不适合长时间的检测。此外，现有溶酶体靶向基团集中于传统的吗啉环和二甲氨基结构，这类弱碱性基团容易聚集在弱酸性溶酶体中引起溶酶体的“碱化效应”，长时间作用会导致细胞中毒。因此，需要开发新型的溶酶体靶向探针用于溶酶体内pH的检测。本专利技术引入能够有效避免溶酶体的“碱化效应”的二乙二醇单甲醚为新型溶酶体靶向基团，利用具有优良pH响应荧光性质的罗丹明B为荧光团母体结构，设计合成了新型pH荧光探针RML，通过对细胞溶酶体内pH的特异性检测实现对细胞自噬过程的监测。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种溶酶体靶向pH荧光探针RML的制备方法；目的之二是提供该荧光探针的用途，即用于制备动物细胞自噬过程中溶酶体内pH的检测试剂。为了达到上述目的，本专利技术采用了下列技术方案：一种监测细胞自噬的溶酶体靶向pH荧光探针的结构式为：一种监测细胞自噬的溶酶体靶向pH荧光探针的制备方法，包括如下步骤：(1)将2-(2-氨基乙基)-3'，6'-双(二乙氨基)螺环[异吲哚-1,9'-黄原]-3-酮和2-(2-甲氧基乙氧基)4-甲基苯磺酸乙酯溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加热回流反应，体系冷却至室温，减压旋蒸除去N,N-二甲基甲酰胺溶剂制得粗品；(2)将步骤(1)所制得的粗品经硅胶柱色谱提纯得到淡黄色固体为权利要求1所述的荧光探针。进一步，所述一种监测细胞自噬的溶酶体靶向pH荧光探针的制备方法，步骤(1)中的2-(2-氨基乙基)-3'，6'-双(二乙氨基)螺环[异吲哚-1,9'-黄原]-3-酮和2-(2-甲氧基乙氧基)4-甲基苯磺酸乙酯的摩尔比是1:1.5～2，所述加热回流反应的反应温度为135℃，反应时间为12～15h。进一步，所述一种监测细胞自噬的溶酶体靶向pH荧光探针的制备方法，步骤(2)中的硅胶柱色谱洗脱剂的体积配比为氯仿:甲醇＝20:1。一种监测细胞自噬的溶酶体靶向pH荧光探针的应用，在定性检测制备动物细胞溶酶体pH变化时作为检测试剂。一种监测细胞自噬的溶酶体靶向pH荧光探针的应用，作为检测试剂，通过检测制备动物细胞溶酶体pH的变化以实现对细胞自噬过程的监测。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：(1)所述荧光探针RML合成步骤简单，成本低廉，易于大规模生产，具有潜在的商品化应用价值；(2)所述荧光探针RML利用新型的二乙二醇单甲醚作为细胞内溶酶体的靶向基团，有效避免传统溶酶体靶向基团(如吗啉环与二甲氨基等)的“碱化效应”；(3)所述荧光探针RML以罗丹明B为荧光团母体结构，以及pH响应基团，利用H+诱导罗丹明B的环内酰胺形成开环形式，导致荧光增强，实现对pH高灵敏检测，并且其它氨基酸和离子不干扰对pH的检测；(4)pKa值为4.96，pH响应线性范围4.5～5.7，非常适合溶酶体内弱酸性环境pH的检测。(5)该荧光探针RML具有良好的细胞膜渗透性，能够靶向标记溶酶体，且通过检测溶酶体pH的变化实现对细胞自噬过程的可视化监测，在溶酶体pH生理学和病理学研究中具有潜在的应用前景。(6)所述的检测手段简单，只需包括荧光分光光度计和激光共聚焦显微镜。附图说明图1a为本专利技术探针RML的核磁表征，1H-NMR谱；图1b为本专利技术探针RML的核磁表征，13CNMR谱；图2为本专利技术探针RML的质谱表征，LC-MS谱；图3为本专利技术探针RML在不同pH值的缓冲溶液中的紫外吸收光谱图；图4为本专利技术探针RML在自然光下识别H+前后溶液颜色变化，由无色变为粉色；图5为本专利技术探针RML与不同pH值的缓冲溶液中的荧光发射光谱图；图6为本专利技术探针RML在紫外光下识别H+前后溶液荧光颜色变化，由无色变为红色；图7为本专利技术探针RML的荧光强度I583随pH值变化的sigmoidal拟合曲线；pKa值为4.96，pH响应线性范围4.5～5.7；图8为本专利技术探针RML分别在pH为7.4和pH为4.4时，在常见金属离子、阴离子和氨基酸小分子存在下对H+的选择性；为本专利技术探针RML的荧光强度I583随pH值变化的sigmoidal拟合曲线；pKa值为4.96，pH响应线性范围4.5～5.7；图9为本专利技术探针RML在HeLa细胞培养12h后的细胞存活率(探针浓度分别为0μM、1μM、5μM、10μM、15μM、20μM)；图10为本专利技术探针RML分别与市售绿色溶酶体特异选择性染料(LysoTrackerGreenDND-26)和绿色线粒体特性选择性染料(MitoTrackergreen)在pH值为7.4的条件下共同孵育30min的共定位荧光成像图；图11为本专利技术探针RML分别在pH7.40，pH6.00，pH5.00和pH4.50时，与HeLa细胞共同孵育10min的激光共聚焦成像图；图12为本专利技术探针RML分别在富含营养物质的正常培养基(Rich-nutrient)、Hank’sBal本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种监测细胞自噬的溶酶体靶向pH荧光探针，其特征在于，所述监测细胞自噬的溶酶体靶向pH荧光探针结构式为：/n

【技术特征摘要】
1.一种监测细胞自噬的溶酶体靶向pH荧光探针，其特征在于，所述监测细胞自噬的溶酶体靶向pH荧光探针结构式为：





2.一种监测细胞自噬的溶酶体靶向pH荧光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将2-(2-氨基乙基)-3'，6'-双(二乙氨基)螺环[异吲哚-1,9'-黄原]-3-酮和2-(2-甲氧基乙氧基)4-甲基苯磺酸乙酯溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加热回流反应，体系冷却至室温，减压旋蒸除去N,N-二甲基甲酰胺溶剂制得粗品；
(2)将步骤(1)所制得的粗品经硅胶柱色谱提纯得到淡黄色固体为所述监测细胞自噬的溶酶体靶向pH荧光探针。


3.根据权利要求2一种监测细胞自噬的溶酶体靶向pH荧光探针的制备方法，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晓东，樊丽，董川，双少敏，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：山西;14