本发明专利技术属药物合成领域，具体涉及光敏感复合物cGS‑mPEG及cIN‑mPEG的合成工艺及其在制备抗菌药物中的用途。本发明专利技术以4'‑羟基‑3'‑甲氧基苯乙酮为起始原料制备光敏感基团2‑硝基苄基(2‑nitrobenzyl,NB)，再通过在侧链氨基位置引入该光敏感基团来预先制备光敏感的鸟氨酸和赖氨酸；通过固相多肽合成制备得到含光敏感基团的抗菌肽Gramicidin S(GS)和Indolicidin(IN)。多肽与单甲氧基聚乙二醇（monomethoxy polyethylene glycol,mPEG）的连接通过“点击”反应(click reaction)的策略。mPEG先通过叠氮取代，再与光敏感基团的炔烃发生‘点击’反应从而将多肽与mPEG进行连接，制备得到cGS‑mPEG和cIN‑mPEG。该类复合物未被UV照射前，无溶血副作用、无细胞毒且无抗菌活性，被UV照射激活后，复合物释放GS及IN原型，显示出抑菌活性。
Synthesis of pegylated peptide prodrug based on light regulation and its application in the preparation of antibacterial drugs
【技术实现步骤摘要】
基于光调节的聚乙二醇化多肽前药合成工艺及其在制备抗菌药物中的用途
本专利技术属药物合成领域，具体涉及光敏感复合物cGS-mPEG及cIN-mPEG的合成工艺及其在制备抗菌药物中的用途。
技术介绍
天然抗菌肽（Antimicrobialpeptides，AMPs）是生物体经诱导产生的具有抗菌活性的一类小分子多肽，来源广泛，其分子量小，大约在1~6kD之间，耐热、耐酸性强，水溶性好，显示出高效的杀菌能力和广谱的抗菌活性，包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、寄生虫、病毒和肿瘤细胞。抗菌肽作用机制独特，主要是通过破坏细菌细胞膜造成胞质流失而诱导细菌死亡，该作用机制最大的特点在于不容易引起细菌耐药性。在当前耐药菌形势严峻的情况下，抗菌肽不失为一种具有广泛使用前景的抗菌药物。然而，天然抗菌肽往往具有较强的溶血副作用，且对酶解代谢稳定性不高，这些缺点严重影响了抗菌肽的临床使用。为此，在不影响抗菌肽生物活性的情况下，改善其溶血及细胞毒活性，并提高代谢稳定性以适应临床需求是目前抗菌肽药物研发领域的热点课题。本专利技术利用前药原理，以GramicidinS(GS)和Indolicidin(IN)为例，成功地开发出一条基于光引发的抗菌肽前药的合成路线，并对其进行体外研究。在对抗菌肽聚乙二醇化修饰后，多肽前药的溶血和细胞毒活性明显降低，且代谢稳定性大幅提高。在经过紫外光照射之后，多肽前药可重新释放出具有活性的抗菌肽分子。由于未经紫外照射的多肽前药未显示出抗菌活性，具有明显的专一性和特殊性。为此，该项合成技术可有效地进行靶向治疗，且通过光调节活性药物的释放浓度及作用部位，这对于后期开发天然抗菌肽作为临床抗癌药、抗菌药具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是合成具有感光活性的天然抗菌肽（Antimicrobialpeptides，AMPs），具体涉及GramicidinS(GS)和Indolicidin（IN）感光化合物的合成制备方法和在抑菌活性中的用途。本专利技术通过药物化学合成方法，将GramicidinS(GS)中的鸟氨酸残基与光敏感基团2-nitrobenzyl(NB)进行连接，Indolicidin（IN）中的赖氨酸与光敏感基团2-nitrobenzyl(NB)进行连接，并连接不同分子量的单甲氧基聚乙二醇（mPEG），使其溶血及细胞毒活性消失。虽然抑菌活性也受到抑制，但通过紫外照射后，其抗菌肽GS和IN以原型释放，在光照射部位重新显示出抗菌活性.本专利技术不仅适用于环状抗菌肽GramicidinS也适用于链状抗菌肽Indolicidin。本专利技术所述的由GramicidinS(GS)合成的光敏感复合物cGS-mPEG的结构特征描述如下：1.cGS-mPEG复合物的光解动力学曲线：高效液相色谱HPLC检测cGS-mPEG复合物在UV光照下(365nm,172mW/cm2)的光解曲线（0-160min）；随着UV照射时间延长，cGS-mPEG逐渐分解，而GS原型则缓慢增加，说明该复合物分解与UV照射的时间呈正相关，见图2和图3；2.cGS-mPEG复合物质谱图，经过160min的照射，从质谱中明显出现GS和NB-mPEG的质谱峰.验证了cGS-mPEG的组成，见图4；cGS-mPEG活性评价如下：1.通过体外溶血实验发现cGS-mPEG溶血活性显著降低，且在<100uM的浓度范围内，对溶血副作用是基本可以忽略，见图5；2.通过细胞毒活性实验发现cGS-mPEG浓度在1-25uM范围内，不显示细胞毒活性，而其原型GS在浓度>5uM时具有显著的细胞毒活性，说明cGS-mPEG对溶血副作用是基本可以忽略，见图6及图7；3.通过抑菌实验发现cGS-mPEG经UV照射后，会分解出GS原型，产生明显的抑菌活性，而未被照射的地方，细菌正常生长，因此呈现出与照射范围类似的菌圈，见图8。本专利技术所述的由Indolicidin合成的光敏感复合物cIN-mPEG的结构特征描述如下：1.cIN-mPEG复合物的光解动力学曲线：高效液相色谱HPLC检测cIN-mPEG复合物在UV光照下(365nm,172mW/cm2)的光解曲线（0-60min）；随着UV时间的照射时间延长，cIN-mPEG逐渐分解，而Indolicidin原型则缓慢增加，说明该复合物分解与UV照射的时间呈正相关，见图9和图10；2.cIN-mPEG复合物质谱图，经过60min的照射，从质谱中明显出现Indolicidin和NB-mPEG的质谱峰.验证了cIN-mPEG的组成，见图11；cIN-mPEG活性评价如下：1.通过体外溶血实验发现cIN-mPEG溶血活性显著降低，且在<100uM的浓度范围内，对溶血副作用是基本可以忽略，见图12。2.通过细胞毒活性实验发现cIN-mPEG浓度在1-25uM范围内，不显示细胞毒活性，而其原型GS在浓度>25uM时具有显著的细胞毒活性，说明cGS-mPEG对溶血副作用是基本可以忽略，见图13及图14。附图说明图1为光敏感鸟氨酸和赖氨酸的合成路线，以及叠氮化mPEG的合成路线；图2为cGS-mPEG2000光解动力学HPLC分析图；图3为cGS-mPEG2000光照时间-峰面积图；图4为cGS-mPEG2000光解产物质谱图；图5为cGS-mPEG复合物与GS溶血副作用比较；图6为cGS-mPEG2000与GS细胞毒性比较（10%胎牛血清培养条件）；图7为cGS-mPEG2000与GS细胞毒性比较（1%胎牛血清培养条件）；图8为细菌培养光照造型实验，接受光照的区域没有细菌生长，反之则细菌正常生长；图9为cIN-mPEG2000光解动力学HPLC分析图；图10为cIN-mPEG2000光照时间-峰面积图；图11为cIN-mPEG2000光解产物质谱图；图12为cIN-mPEG2000与IN溶血副作用比较；图13为cIN-mPEG2000与IN细胞毒性比较（10%胎牛血清培养条件）；图14为cIN-mPEG2000与IN细胞毒性比较（1%胎牛血清培养条件）；图15为cGS-mPEG2000核磁氢谱图；图16为cGS-mPEG2000质谱图；图17为GS核磁氢谱图；图18为GS质谱图；图19为cIN-mPEG2000质谱图。具体实施方式以4'-羟基-3'-甲氧基苯乙酮为起始原料制备光敏感基团2-nitrobenzyl(NB)。首先第一步用炔丙基溴取代酚羟基，以避免多余的保护和脱保护的步骤，第二步通过加入适量KNO3和TFA对苯环上2号位进行硝基取代，第三步将羰基还原并用N,N'-琥珀酰亚胺基碳酸酯对其进行保护以制得光敏感基团2-nitrobenzyl(NB)。通过在侧链氨基位置引入光敏感基团2-nitrobenzyl(NB)来预先制备光敏感的鸟氨本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于光调节的聚乙二醇化多肽前药合成工艺，其特征在于：所述多肽前药为光敏感复合物cGS-mPEG及cIN-mPEG，其分子结构如下：/n
【技术特征摘要】
1.一种基于光调节的聚乙二醇化多肽前药合成工艺，其特征在于：所述多肽前药为光敏感复合物cGS-mPEG及cIN-mPEG，其分子结构如下：
；
合成工艺为：通过在GramicidinS和Indolicidin的侧链氨基位置引入光敏感基团2-nitrobenzyl来预先制备光敏感的鸟氨酸和赖氨酸；再通过固相多肽合成制备得到含光敏感基团的GS和IN；多肽与mPEG的连...
【专利技术属性】
技术研发人员：万阳，管钦坤，胡成飞，温泉，金一，
申请(专利权)人：江西中医药大学，
类型：发明
国别省市：江西;36
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