一种健脾清热活血方防治溃结癌变机制的检测方法技术

本发明专利技术属于癌变机制验证技术领域，公开了一种健脾清热活血方防治溃结癌变机制的检测方法，所述健脾清热活血方防治溃结癌变(UCAC)与介导PI3K‑Akt/mTOR通路协同Wnt通路调控P‑β‑catenin相关，在体实验采用现代生物技术检测结肠黏膜形态、超微结构、PI3K‑Akt/mTOR通路相关指标及p‑β‑catenin核内转位；离体实验检测细胞增殖、凋亡、周期、PI3K‑Akt/mTOR通路中指标及β‑catenin核内转位。本发明专利技术证实健脾清热活血方防治UCAC可能与介导PI3K‑Akt/mTOR通路协同Wnt通路调控P‑β‑catenin相关，为中医药防治UCAC提供新思路。

A test method for the mechanism of Jianpi Qingre Huoxue Recipe in preventing and curing the canceration of ulceration

【技术实现步骤摘要】
一种健脾清热活血方防治溃结癌变机制的检测方法
本专利技术属于癌变机制验证
，尤其涉及一种健脾清热活血方防治溃结癌变机制的检测方法。
技术介绍
目前，最接近的现有技术：溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis，UC)是一种易发生癌变的非可控炎症性疾病，近年来中国发病率呈逐年上升趋势，其中β-catenin核内磷酸化及其异常转位，K-ras基因突变，p53、表皮生长因子(epidermalgrowthfactor，EGF)及其受体家族(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)异常活化等在溃疡性结肠炎相关癌变(ulcerativecolitisassociatedcarcinogenesis，UCAC)的发生中具有重要作用。但现有技术中关于健脾清热活血方防治溃结癌变机制的检测方法尚未见报道。前期研究本专利技术已经证实健脾清热活血方药具有防治溃结癌变的效用，其靶点可能与调控Wnt/β-catenin通路，介导β-catenin磷酸化相关。但是，炎症状态下磷脂酰肌醇3-激酶/丝-苏氨酸激酶/mTOR(phosphoinositide3-kinase/serinethreininekinase/mTOR,PI3K-Akt/mTOR)协同wnt通路调控P-β-catenin介导溃结癌变发生、发展中作用是不容忽视的。因此，课题组通过观察溃结癌变结肠黏膜病理组织、超微结构、EGF、EGFR、PI3K、P-AKT、mTOR、CDK1等相关指标变化及P-β-catenin核内异常转位，以及健脾清热活血方对上述指标的影响，分析健脾清热活血方防治UCAC可能机制。综上所述，现有技术存在的问题是：现有技术中关于健脾清热活血方防治溃结癌变机制的检测方法尚未见报道。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种健脾清热活血方防治溃结癌变机制的检测方法。本专利技术是这样实现的，一种健脾清热活血方防治溃结癌变机制的检测方法，具体包括以下步骤：步骤一，在体采用DMH/DSS复合法制备溃结相关癌变模型，将健脾清热活血方作用于所述癌变模型，从PI3K-Akt/mTOR通路介导β-catenin磷酸化中相关指标变化，验证健脾清热活血方药防治溃结相关癌变的机制。步骤二，离体参照血清药理学实验方法，建立健脾清热活血方含药血清质量标准，将含药血清作用于SW480细胞，从PI3K-Akt/mTOR通路介导β-catenin磷酸化中相关指标变化，验证健脾清热活血方药防治结肠癌的机制。步骤三，综合在体、离体结果对健脾清热活血方防治溃结相关癌变机制进行科学解析，提供理论依据。进一步，步骤一中，所述在体验证方法包括：(1)选择Balb/c小鼠为研究对象，除正常组外，其余各组均采用DMH/DSS复合法制备溃结相关癌变动物模型，分成模型组、治疗组、对照组。(2)采用水提法提取中药复方健脾清热活血方中救必应、白术、白芍、炙甘草、水蛭、三七有效成分。(3)应用健脾清热活血方干预溃结相关癌变PI3K-Akt/mTOR/P-β-catenin通路，并观察相关指标变化。(4)应用光镜以及透射电镜下观察溃结癌变小鼠结肠组织形态学改变及超微结构变化；分析PI3K-Akt/mTOR通路中EGF、EGFR、P110、P85、β-catenin、P-Akt、mTOR、CDK1蛋白及其mRNA表达变化。(5)激光共聚焦显微镜+免疫荧光染色检测p-β-catenin核内转位；观察健脾清热活血中药指标的影响，验证健脾清热活血中药防治溃结癌变的分子生物学靶点。进一步，步骤二中，所述离体验证方法包括：(Ⅰ)制备中药健脾清热活血中药含药血清，应用色谱和质谱联合法测定健脾清热活血中药含药血清有效组分。(Ⅱ)培养人结肠癌SW480细胞，分别予空白血清、健脾清热活血中药含药血清、LY294002分别处理SW480细胞，应用Western-blot及Real-timePCR技术检测EGF、EGFR、P110、P85、P-Akt、mTOR、P-β-catenin、CDK1蛋白及其mRNA表达。(Ⅲ)激光共聚焦显微镜+免疫荧光染色等技术检测β-catenin及其磷酸化后核内转位；验证PI3K-Akt/mTOR信号通路调控P-β-catenin介导溃结相关结肠癌变的分子生物学机制及健脾清热活血方对该通路的影响。进一步，所述步骤一中DMH/DSS复合法制备溃结相关癌变模型的过程，如下：取5周的小鼠，喂养1周后，按照一定的分类标准，划分成不同的对比组；对比组为正常组和模型组。模型组以每周腹腔注射百分之0.4的DMH，自由引用百分之三DSS连续2周，以三周为一个周期，进行5个循环。在循环过程中，对模型组的小鼠进行观察，截取全部结肠，利用光学电子显微镜对结肠进行观察，利用液氮和甲醛进行验证检测。进一步，所述对模型组的小鼠进行观察，在全部结肠中选择观察样本，具体处理过程如下：利用液氮和甲醛进行处理，静止一端时间；取一定长度的结肠组织，利用相应的器具进行固定，脱水、包埋，切片，并对组织进行染色，将处理完成的组织放置在载波片上，利用光学显微镜进行观察。进一步，所述步骤三中对健脾清热活血方防治溃结相关癌变机制进行科学解析方法，具体包括：利用相应的统计分析程序，将上述检测到的数据利用整体数据均值与标准差进行表示。将整体数据均值与标准差分别代入正态分布验证方法，进行验证整体数据是否符合正态分布验证模型。符合正态分布验证模型数据采用单一元素进行检验分析。不符合正态分布验证模型数据采用对比分析方法，对两者是否存在差异。进一步，(Ⅰ)中药健脾清热活血中药含药血清的制备方法，具体过程如下：根据小鼠的身体状态信息，实施一定量的健脾清热活血中药；利用相应的药剂以灌胃的方式对小鼠进行处理。采血时，用10％的水合氯醛以体重0.3ml/100g的比例行麻醉处理。提取液制备：每200ul蛋白提取液中加入2ul蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用；取血清样本，每100ul血清样本中加入200ul蛋白提取液，充分混匀后，在4℃条件下静置5分钟。在4℃,14000g条件下离心10分钟；将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到血清蛋白；将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验；根据相关实验要求用蛋白稀释液稀释血清蛋白至所需浓度。进一步，(Ⅱ)小鼠UCAC结肠EGF、EGFR、P110、P85、P-Akt、mTOR、CDK1、P-β-catenin蛋白表达的检测方法为：采用Westernblot技术检测EGF、EGFR、P110、P85、P-Akt、mTOR、CDK1以及P-β-catenin蛋白表达，Westernblot检测以GAPDH作为内参，用光密度扫描仪对蛋白含量进行密度分析，以目的蛋白与GADPH比值作为目的蛋白的相对含量；具体操作步骤如下本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种健脾清热活血方防治溃结癌变机制的检测方法，其特征在于，所述健脾清热活血方防治溃结癌变机制的检测方法，具体包括以下步骤：/n步骤一，在体采用DMH/DSS复合法制备溃结相关癌变模型，将健脾清热活血方作用于所述癌变模型，从PI3K-Akt/m TOR通路介导β-catenin磷酸化中相关指标变化，验证健脾清热活血方药防治溃结相关癌变的机制；/n步骤二，离体参照血清药理学实验方法，建立健脾清热活血方含药血清质量标准，将含药血清作用于SW480细胞，从PI3K-Akt/mTOR通路介导β-catenin磷酸化中相关指标变化，验证健脾清热活血方药防治结肠癌的机制；/n步骤三，综合在体、离体结果对健脾清热活血方防治溃结相关癌变机制进行科学解析，提供理论依据。/n

【技术特征摘要】
1.一种健脾清热活血方防治溃结癌变机制的检测方法，其特征在于，所述健脾清热活血方防治溃结癌变机制的检测方法，具体包括以下步骤：
步骤一，在体采用DMH/DSS复合法制备溃结相关癌变模型，将健脾清热活血方作用于所述癌变模型，从PI3K-Akt/mTOR通路介导β-catenin磷酸化中相关指标变化，验证健脾清热活血方药防治溃结相关癌变的机制；
步骤二，离体参照血清药理学实验方法，建立健脾清热活血方含药血清质量标准，将含药血清作用于SW480细胞，从PI3K-Akt/mTOR通路介导β-catenin磷酸化中相关指标变化，验证健脾清热活血方药防治结肠癌的机制；
步骤三，综合在体、离体结果对健脾清热活血方防治溃结相关癌变机制进行科学解析，提供理论依据。


2.如权利要求1所述的健脾清热活血方防治溃结癌变机制的检测方法，其特征在于，步骤一中，所述在体验证方法包括：
(1)选择Balb/c小鼠为研究对象，除正常组外，其余各组均采用DMH/DSS复合法制备溃结相关癌变动物模型，分成模型组、治疗组、对照组；
(2)采用水提法提取中药复方健脾清热活血方中救必应、白术、白芍、炙甘草、水蛭、三七有效成分；
(3)应用健脾清热活血方干预溃结相关癌变PI3K-Akt/mTOR/P-β-catenin通路，并观察相关指标变化；
(4)应用光镜以及透射电镜下观察溃结癌变小鼠结肠组织形态学改变及超微结构变化；分析PI3K-Akt/mTOR通路中EGF、EGFR、P110、P85、β-catenin、P-Akt、mTOR、CDK1蛋白及其mRNA表达变化；
(5)激光共聚焦显微镜+免疫荧光染色检测p-β-catenin核内转位；观察健脾清热活血中药指标的影响，验证健脾清热活血中药防治溃结癌变的分子生物学靶点。


3.如权利要求1所述的健脾清热活血方防治溃结癌变机制的检测方法，其特征在于，步骤二中，所述离体验证方法包括：
(Ⅰ)制备中药健脾清热活血中药含药血清，应用色谱和质谱联合法测定健脾清热活血中药含药血清有效组分；
(Ⅱ)培养人结肠癌SW480细胞，分别予空白血清、健脾清热活血中药含药血清、LY294002分别处理SW480细胞，应用Western-blot及Real-timePCR技术检测EGF、EGFR、P110、P85、P-Akt、mTOR、P-β-catenin、CDK1蛋白及其mRNA表达；
(Ⅲ)激光共聚焦显微镜+免疫荧光染色等技术检测β-catenin及其磷酸化后核内转位；验证PI3K-Akt/mTOR信号通路调控P-β-catenin介导溃结相关结肠癌变的分子生物学机制及健脾清热活血方对该通路的影响。


4.如权利要求1所述健脾清热活血方防治溃结癌变机制的检测方法，其特征在于，所述步骤一中DMH/DSS复合法制备溃结相关癌变模型的过程，如下：
取5周的小鼠，喂养1周后，按照一定的分类标准，划分成不同的对比组；对比组为正常组和模型组；
模型组以每周腹腔注射百分之0.4的DMH，自由引用百分之三DSS连续2周，以三周为一个周期，进行5个循环；
在循环过程中，对模型组的小鼠进行观察，截取全部结肠，利用光学电子显微镜对结肠进行观察，利用液氮和甲醛进行验证检测。


5.如权利要求4所述健脾清热活血方防治溃结癌变机制的检测方法，其特征在于，所述对模型组的小鼠进行观察，在全部结肠中选择观察样本，具体处理过程如下：
利用液氮和甲醛进行处理，静止一端时间；取一定长度的结肠组织，利用相应的器具进行固定，脱水、包埋，切片，并对组织进行染色，将处理完成的组织放置在载波片上，利用光学显微镜进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：张涛，陈思羽，黄会云，陈远能，郑东林，黄适，
申请(专利权)人：广西中医药大学附属瑞康医院，
类型：发明
国别省市：广西;45