肝素钠中硫酸乙酰肝素杂质检测分析方法技术

本发明专利技术公开了一种肝素钠中硫酸乙酰肝素杂质检测分析方法，包括采用液相色谱仪、SAX强阴离子交换色谱柱，磷酸二氢钠溶液为流动相A相，流动相B相为含高氯酸钠的流动相A，梯度洗脱进行检测分析。利用本发明专利技术可以通过简单的液相色谱测定，准确分析肝素钠、硫酸乙酰肝素的相对含量，可更快速、准确地对肝素钠中的硫酸乙酰肝素杂质进行定性和含量分析。

Determination and analysis of heparin sulfate impurities in heparin sodium

【技术实现步骤摘要】
肝素钠中硫酸乙酰肝素杂质检测分析方法
本专利技术涉及生物医药领域，更具体地说，尤其涉及一种肝素钠中硫酸乙酰肝素杂质检测分析方法。
技术介绍
肝素是一类重要的多糖药物，在临床上主要是作为抗凝血药物用于治疗由深层静脉血栓的形成而导致的血栓栓塞性疾病，同时还具有调整血脂浓度、抗炎及抗过敏等多种生物学上的效用。现代肝素主要从猪小肠黏膜中提取，由于与肝素并不是单独存在，它会与其他几种糖胺聚糖共同存在，生产过程中会伴随比如硫酸皮肤素（Dermatansulfate，DS）、硫酸乙酰肝素（Heparansulfate，HS）等物质共存，这些物质都是由一类重复二糖结构单元组成的线性长链大分子多糖，关于它们的分析检测对于肝素的生产和质检有着非常重要的意义。肝素和硫酸乙酰肝素主要是由重复的糖醛酸和氨基葡萄糖通过1,4糖苷键连接而成，不同的是肝素是由艾杜糖醛酸，而硫酸乙酰肝素是由葡萄糖醛酸，而且硫酸乙酰肝素的硫酸化程度较肝素低，如上式R同R2可以被H或SO3-取代，R3可以为H、acetyl（乙酰基）或SO3-取代；至于硫酸皮肤素主要是由重复的糖醛酸和氨基半乳糖通过1,3糖苷键连接而成。这些糖胺聚糖结构十分相似且复杂，大多共存于同一生物体内甚至同一糖链上，因此分离存在很大的难度，要获得完全单一种类的糖胺聚糖十分困难。为了确保肝素的用药安全性，必须提高肝素的纯度，对于这些结构类似的糖胺聚糖杂质是否做到去除彻底需要进行有效确认。目前对于糖胺聚糖多糖的分离分析有核磁共振（NMR）、毛细管电泳法（CE）、高效液相色谱法（HPLC）以及质谱联用等方法，出于工业生产成本等经济因素以及实验室可实施性方面的考虑,高效液相色谱最具有研究价值。2009年美国戴安公司在对阴离子交换HPLC法进行了改进和优化之后，推出了新的强阴离子交换HPLC检测方法（ThermoFisherScientificInc．Determinationofover-sulfatedchondroitinsulfateanddermatansulfateinheparinsodiumusinganion-exchangechromatographywithuvdetection.［EB/OL］.2010.［2012-05-11］），并被美国药典USP33-NF28所采用；欧洲药典委员会也在EP7.0推出了改进的强阴离子交换方法，但需要对肝素钠进行亚硝酸盐降解的样品前处理。中国药典2010年版推出了与USP33-NF28相一致的强阴离子交换方法。但是上述的强阴离子交换色谱检测方法并不十分完美，存在着基线漂移严重等缺陷，即使是HashiiNHashiiN，KawasakiN,ItohS,etal.HeparinidentificationtestandpuritytestforOSCSinheparinsodiumandheparincalciumbyweakanion-exchangehigh-performanceliquidchromatography.Biologicals,2010,38(5):539报道的弱阴离子交换方法存在同样的问题。此外，上述这些方法虽然能够分离测定HP、DS的相对含量以及污染物过硫酸化软骨素（OSCS）的相对含量，但对于同样可能共存的HS都无法有效分离、准确测定。因此，急需要一种可以同时有效分离检测多种糖胺聚糖的液相方法，确认糖胺聚糖类药物的组成，以实现指导工业生产和药品组成分析，确保药物安全性的目的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种肝素钠中硫酸乙酰肝素杂质检测分析方法，采用高效液相色谱仪进行检测分析，可准确分离测定肝素钠和硫酸乙酰肝素的相对组分含量，提高了肝素钠产品中硫酸乙酰肝素杂质检出的灵敏度和准确性。本专利技术的目的通过如下技术方案来实现：一种肝素钠中硫酸乙酰肝素杂质检测分析方法，所述方法采用高效液相色谱仪进行检测分析，液相色谱条件为：采用SAX强阴离子交换色谱柱；流动相流速为0.1-0.3ml/min，检测波长为200nm-215nm，待测样品进样量为2-20μl；流动相A为2-3mM磷酸二氢钠溶液，流动相B为含1-2M高氯酸钠的流动相A，流动相A、B均用磷酸调pH至2.0-4.0；起始流动相A︰流动相B=80︰20等度洗脱2-5分钟，然后流动相B连续性递增从20%逐渐升到50%，流动相A连续性递减从80%逐渐减到50%洗脱20-30分钟，再然后流动相B连续性递增从50%逐渐升到80%，流动相A连续性递减从50%逐渐减到20%洗脱15-20分钟，保持该比例继续洗脱5-10分钟后，在1-2分钟内迅速调整流动相A从20%升到80%，流动相B从80%减到20%，继续洗脱30-50分钟，检测结束。利用本专利技术提供的液相色谱检测方法，可以精确地分离检测出肝素钠（HP）和硫酸乙酰肝素（HS）的相对含量。附图说明图1所示为实施例1中水（空白）的液相色谱图；图2所示为实施例1中硫酸乙酰肝素的液相色谱图；图3所示为实施例1中肝素钠的液相色谱图；图4所示为实施例1中硫酸皮肤素的液相色谱图；图5所示为实施例1中混合溶液的液相色谱图；图6所示为实施例2中溶液1的液相色谱图；图7所示为实施例2中溶液2的液相色谱图；图8所示为实施例2中溶液3的液相色谱图；图9所示为实施例2中溶液4的液相色谱图；图10所示为实施例2中溶液5的液相色谱图；图11所示为实施例2中溶液6的液相色谱图；图12所示为实施例2中溶液7的液相色谱图；图13所示为实施例3中T1-T6溶液的液相色谱图；图14所示为比较例1获得的高效液相色谱图；图15所示为比较例2获得的高效液相色谱图；图16所示为比较例3获得的高效液相色谱图；图17所示为比较例4获得的高效液相色谱图。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所使用的仪器包括：SHIMADZU（岛津）®LC-20AD液相色谱仪；硫酸乙酰肝素标准品（GLYCOSCI批号：ZZS18040905）；肝素钠标准品（中国食品药品检定研究院批号：140787-2010）；硫酸皮肤素标准品（中国食品药品检定研究院批号：140788-2010）；硫酸软骨素标准品（中国食品药品检定研究院批号：140792-2017）；多硫酸软骨素标准品（中国食品药品检定研究院批号：140789-2010）；磷酸二氢钠（国药集团化学试剂有限公司，批号：20150228）；高氯酸钠（国药集团化学试剂有限公司，批号：20170306）；磷酸（江苏强盛功能化学股份有限公司，批号：20140203）。实施例1分离效果本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肝素钠中硫酸乙酰肝素杂质检测分析方法，其特征在于：所述方法采用高效液相色谱仪进行检测分析，液相色谱条件为：/n采用SAX强阴离子交换色谱柱；/n流动相流速为0.1-0.3ml/min；/n检测波长为200nm-215nm；/n待测样品进样量为2-20μl；/n流动相A为2-3mM磷酸二氢钠溶液，流动相B为含1-2M高氯酸钠的流动相A，流动相A、B均用磷酸调pH至2.0-4.0；/n起始流动相A︰流动相B=80︰20等度洗脱2-5分钟，然后流动相B连续性递增从20%逐渐升到50%，流动相A连续性递减从80%逐渐减到50%洗脱20-30分钟，再然后流动相B连续性递增从50%逐渐升到80%，流动相A连续性递减从50%逐渐减到20%洗脱15-20分钟，保持该比例继续洗脱5-10分钟后，在1-2分钟内迅速调整流动相A从20%升到80%，流动相B从80%减到20%，继续洗脱30-50分钟。/n

【技术特征摘要】
1.一种肝素钠中硫酸乙酰肝素杂质检测分析方法，其特征在于：所述方法采用高效液相色谱仪进行检测分析，液相色谱条件为：
采用SAX强阴离子交换色谱柱；
流动相流速为0.1-0.3ml/min；
检测波长为200nm-215nm；
待测样品进样量为2-20μl；
流动相A为2-3mM磷酸二氢钠溶液，流动相B为含1-2M高氯酸钠的流动相A，流动相A、B均用磷酸调pH至2.0-4.0；
起始流动相A︰流动相B=80︰20等度洗脱2-5分钟，然后流动相B连续性递增从20%逐渐升到50%，流动相A连续性递减从80%逐渐减到50%洗脱20-30分钟，再然后...

【专利技术属性】
技术研发人员：干浩，董凯，张真庆，罗锡川，唐红，陈磊，邱飘飘，韩自江，陈新伟，
申请(专利权)人：湖北亿诺瑞生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42