一种利用发根农杆菌诱导产生鸭茅毛状根的方法技术

本发明专利技术公开一种利用发根农杆菌诱导产生鸭茅毛状根的方法，包括以下步骤：(1)发根农杆菌活化；(2)侵染；(3)鸭茅毛状根的诱导；(4)除菌培养：(5)继代培养：可实现鸭茅毛状根的高效诱导和规模化培养，生产周期短、生产成本低。

A method of using Agrobacterium rhizogenes to induce hairy roots of Dactylis glomerata

【技术实现步骤摘要】
一种利用发根农杆菌诱导产生鸭茅毛状根的方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种利用发根农杆菌诱导产生鸭茅毛状根的方法。
技术介绍
鸭茅(DactylisglomerataL.)是禾本科，鸭茅属多年生草本植物。鸭茅草质柔软，牛、马、羊、兔等均喜食。幼嫩时尚可用以喂猪。叶量丰富，叶占60％，茎约占40％。鸭茅可作用放牧或制作干草，也可收割青饲或制作青贮料。鸭茅具有生长迅速、分蘖能力强、产量高、耐瘠薄等优良特性，是中国南方草地农业生产中广泛使用的草种。随着分子生物学的发展，很多涉及到基因功能验证的实验需要通过组织培养进行遗传转化。传统的组培方式多以鸭茅的幼嫩花穗，茎节或者幼苗为外植体进行愈伤的诱导，试验耗时，成本较高。
技术实现思路
有鉴于此，本申请提供一种利用发根农杆菌诱导产生鸭茅毛状根的方法，可实现鸭茅毛状根的高效诱导和规模化培养，生产周期短、生产成本低。为解决以上技术问题，本申请提供的技术方案是一种利用发根农杆菌诱导产生鸭茅毛状根的方法，包括以下步骤：(1)发根农杆菌活化：发根农杆菌活化，得到活化的发根农杆菌菌液；(2)侵染：以无菌鸭茅幼苗为外植体，所述活化的发根农杆菌菌液针刺侵染所述无菌鸭茅幼苗茎尖生长点，得到侵染后的外植体；(3)鸭茅毛状根的诱导：吸干所述侵染后的外植体表面菌液后，接种到共培养基上共培养，得到共培养后的外植体；所述共培养基为：MS基本培养基+200umol·L－1AS；(4)除菌培养：所述共培养后的外植体至于除菌培养基上除菌培养，直到彻底去除发根农杆菌，得到彻底除菌后的毛状根；所述除菌培养基为：1/2MS基本培养基+Cef，Cef初始添加浓度为500mg·L－1；(5)继代培养：取所述彻底除菌后的毛状根接种到继代培养基上继代培养；所述继代培养基为：1/2MS固体培养基。优选的，所述继代培养得到继代培养后的鸭茅毛状根所述方法还包括：鸭茅毛状根分子检测；所述鸭茅毛状根PCR检测包括：DNA提取：提取所述继代培养后的鸭茅毛状根DNA；PCR体系：获得含有rolB引物的PCR体系；PCR反应：PCR反应扩增所述继代培养后的鸭茅毛状根Ri质粒rolB基因；PCR扩增产物检测：琼脂糖凝胶电泳检测目标条带。优选的，所述rolB引物为：正向引物，其序列(5'-3')为SEQIDNo：1，GCTCTTGCAGTGCTAGATTT；正向引物，其序列(5'-3')为SEQIDNo：2，GAAGGTGCAAGCTACCTCTC。优选的，所述PCR反应的PCR程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸15min，4℃保温。优选的，所述发根农杆菌为发根农杆菌A4。优选的，所述发根农杆菌菌液菌液浓度为OD600＝0.5～0.6。优选的，所述发根农杆菌活化过程具体包括：I、发根农杆菌划线接种到含50mg·L－1rif的YEB固体培养基上，28℃培养2-3d；II、挑取发根农杆菌单菌落，接菌于YEB液体培养基,28℃，220r·min－1振荡培养12-16h；III、取1ml步骤II得到的菌液接于含50mg·L－1rif的50mLYEB液体培养基中，28℃，220r·min－1振荡，分装于无菌EP管,5000r·min－1离心5min,去上清；IV、用含200umol·L－1AS的MS液体培养基重悬，28℃且黑暗条件下，220r·min－1振荡培养30min，得到活化的发根农杆菌菌液。优选的，所述侵染过程具体包括：以无菌鸭茅幼苗为外植体，使用无菌注射器吸取所述活化的发根农杆菌菌液，针刺侵染所述无菌鸭茅幼苗茎尖生长点，得到侵染后的外植体。优选的，所述共培养过程具体包括：吸干所述侵染后的外植体表面菌液后，接种到共培养基上，23～27℃且黑暗条件下共培养2d，得到共培养后的外植体。优选的，所述除菌培养过程具体包括：所述共培养后的外植体置于1/2MS基本培养基+Cef的除菌培养基上除菌培养，长出毛状根后，更换除菌培养基，逐步降低Cef浓度，直到彻底去除所述发根农杆菌，得到彻底除菌后的毛状根，Cef初始添加浓度为500mg·L－1。优选的，所述更换除菌培养基频率为每周更换一次。优选的，所述除菌培养的条件为：23～27℃，光照强度为1000lx条件下光照培养。优选的，所述继代培养过程具体包括：取所述彻底除菌后的毛状根接种到无菌的1/2MS固体培养基下继代培养。本申请与现有技术相比，其详细说明如下：发根农杆菌诱导极少数单子叶植物(小麦、玉米等)和多数双子叶植物产生毛状根，但目前禾本科牧草很难诱导形成毛状根。本专利技术以无菌鸭茅幼苗为外植体，利用发根农杆菌A4菌株针刺侵染而诱导无菌鸭茅幼苗产生毛状根，通过人工调控优化培养条件，提高毛状根的生长和次生代谢产物的合成，保证毛状根诱导率。保障了无菌鸭茅幼苗的可持续利用。本专利技术鸭茅毛状根是由无菌鸭茅幼苗经过发根农杆菌感染，在感染过程中发根农杆菌将其携带的Ri质粒上的T-DNA转移到植物细胞中，并且在宿主细胞基因组中发生整合，进而形成类似于毛发一样细长的根状组织。毛状根属于激素自养型，可有效降低生产成本。且毛状根粗壮且增殖快，无向地，生产周期短、易规模化、不受外界环境干扰，而且具有生理代谢活力强、有效成分产量高、遗传稳定性好等特点。附图说明图1为实施例1鸭茅毛状根rolB基因的PCR检测；图2为不同菌液浓度侵染鸭茅毛状根诱导率；图3为发根农杆菌侵染的叶片与对照的差异；图3A对照例1为发根农杆菌侵染鸭茅叶片、根段；图3B实施例2发根农杆菌侵染无菌鸭茅幼苗；图3C对照例2发根农杆菌侵染土培鸭茅幼苗；图3D实施例2鸭茅毛状根的诱导；图3E为实施例2为共培养和除菌培养共20d时鸭茅毛状根情况；图3F为实施例2继代培养后的鸭茅毛状根和普通根同时存在。具体实施方式为了使本领域的技术人员更好地理解本专利技术的技术方案，下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的详细说明。供试材料：发根农杆菌：为发根农杆菌A4，市售发根农杆菌菌株A4添加灭菌甘油至终浓度的20％(甘油配80％浓度，高压灭菌后添加)，于-80℃冰箱保存。植物材料：鸭茅‘安巴’由美国种质资源提供，于实验室培养获得无菌苗和土培苗。(3)发根农杆菌培养基YEB液体培养基：琼脂粉15g·L－1+5g·L－1蛋白胨+lg·L－1酵母提取物+5g·L－1蔗糖+0.5g·L－1MgSO4，pH＝7.0-7.2YEB液体培养基：5g·L－1蛋白胨+lg·L－1酵母提取物+5g·L－1蔗糖+0.5g·L－1MgSO4，pH＝7.0-7.2。(4)植物培养基共培养基:MS基本培养基+200umol·L－1AS(39.2mg/l)除本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用发根农杆菌诱导产生鸭茅毛状根的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)发根农杆菌活化：发根农杆菌活化，得到活化的发根农杆菌菌液；/n(2)侵染：以无菌鸭茅幼苗为外植体，所述活化的发根农杆菌菌液针刺侵染所述无菌鸭茅幼苗茎尖生长点，得到侵染后的外植体；/n(3)鸭茅毛状根的诱导：吸干所述侵染后的外植体表面菌液后，接种到共培养基上共培养，得到共培养后的外植体；所述共培养基为：MS基本培养基+200umol·L

【技术特征摘要】
1.一种利用发根农杆菌诱导产生鸭茅毛状根的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)发根农杆菌活化：发根农杆菌活化，得到活化的发根农杆菌菌液；
(2)侵染：以无菌鸭茅幼苗为外植体，所述活化的发根农杆菌菌液针刺侵染所述无菌鸭茅幼苗茎尖生长点，得到侵染后的外植体；
(3)鸭茅毛状根的诱导：吸干所述侵染后的外植体表面菌液后，接种到共培养基上共培养，得到共培养后的外植体；所述共培养基为：MS基本培养基+200umol·L－1AS；
(4)除菌培养：所述共培养后的外植体至于除菌培养基上除菌培养，直到彻底去除发根农杆菌，得到彻底除菌后的毛状根；所述除菌培养基为：1/2MS基本培养基+Cef，Cef初始添加浓度为500mg·L－1；
(5)继代培养：取所述彻底除菌后的毛状根接种到继代培养基上继代培养；所述继代培养基为：1/2MS固体培养基。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述继代培养得到继代培养后的鸭茅毛状根，所述方法还包括：鸭茅毛状根分子检测；
所述鸭茅毛状根PCR检测包括：
DNA提取：提取所述继代培养后的鸭茅毛状根DNA；
PCR体系：获得含有rolB引物的PCR体系；
PCR反应：PCR反应扩增所述继代培养后的鸭茅毛状根Ri质粒rolB基因；
PCR扩增产物检测：琼脂糖凝胶电泳检测目标条带。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发根农杆菌为发根农杆菌A4。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发根农杆菌菌液菌液浓度为OD600＝0.5～0.6。


5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发根农杆菌活...

【专利技术属性】
技术研发人员：张新全，韩佳婷，许蕾，冯光燕，陈诚，张欢，黄琳凯，周美亮，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川;51