【技术实现步骤摘要】
一种表达壳面锚定蛋白硅藻的构建技术与应用方法
本专利技术属于基因的遗传转化
,具体涉及一种表达壳面锚定蛋白硅藻的构建技术与应用方法。
技术介绍
蛋白质是由氨基酸以“脱水缩合”的方式组成的多肽链经过盘曲折叠形成的具有一定空间结构的物质,具有结构组成、催化、调节、贮存和转运等多种生理生化功能。蛋白质固定化是指利用物理、化学或生物方法将蛋白质固定在材料表面,并保持其活性的过程。蛋白质在材料表面的固定化技术有着广泛的应用,比如蛋白分析、药物筛选、和生物催化等等。蛋白质的固定化是一个复杂的动态过程,涉及蛋白质与载体材料之间的多种作用力,如范德华力、氢键、静电吸引等。在固定化过程中,由于蛋白质分子的不稳定性和易变性,使得蛋白质的固定化显得尤为重要和困难。实现蛋白质固定化的方法有很多,可分为物理吸附法、化学方法固定法以及生物亲和吸附法等等。然而,物理吸附法会使蛋白质在材料表面随意排列,不能精确控制蛋白质的吸附量和构象,也不能有选择性的吸附特定的蛋白质,同时其活性部位得不到充分的暴露,从而导致蛋白质的生物活性降低。化学吸附法的操作过程繁杂,吸附过程中化学试剂的加入容易造成蛋白质的变性和失活,因而不能大规模使用。生物亲和吸附法能够选择性的吸附特定的蛋白质并能够保持蛋白质的活性,但是操作步骤繁琐,生产成本较高。蛋白质的固定化一般选用水不溶性的固体材料作为载体,载体的种类很多,来源和性质也各不相同。但都应满足以下条件:(1)来源广泛,价格便宜;(2)有一定的机械强度,不易变形;(3)有较好的酸碱耐受度;(4)固定过程 ...
【技术保护点】
1.一种硅藻壳面锚定蛋白表达载体的构建方法,其特征在于此方法包括以下步骤:/n(1) 基础质粒的构建:参照序列1构建基础质粒pLJ01;/n(2) 功能蛋白基因表达序列设计:根据功能基因序列和硅藻的密码子偏好性,设计适合硅藻表达的功能蛋白基因表达序列;/n(3) 硅藻壳面锚定蛋白表达载体的构建:将硅藻特有启动子、相应抗性筛选标记基因和特有终止子按顺序插入到pLJ01的多克隆位点-1(序列2)位置上,将硅藻特有启动子、锚定蛋白基因序列、功能基因表达序列、荧光筛选标记基因和特有终止子按顺序插入到pLJ01的多克隆位点-2(序列3)位置上,构建硅藻壳面锚定蛋白表达载体。/n
【技术特征摘要】
1.一种硅藻壳面锚定蛋白表达载体的构建方法,其特征在于此方法包括以下步骤:
(1)基础质粒的构建:参照序列1构建基础质粒pLJ01;
(2)功能蛋白基因表达序列设计:根据功能基因序列和硅藻的密码子偏好性,设计适合硅藻表达的功能蛋白基因表达序列;
(3)硅藻壳面锚定蛋白表达载体的构建:将硅藻特有启动子、相应抗性筛选标记基因和特有终止子按顺序插入到pLJ01的多克隆位点-1(序列2)位置上,将硅藻特有启动子、锚定蛋白基因序列、功能基因表达序列、荧光筛选标记基因和特有终止子按顺序插入到pLJ01的多克隆位点-2(序列3)位置上,构建硅藻壳面锚定蛋白表达载体。
2.如权利要求1所述的一种硅藻壳面锚定蛋白表达载体的构建方法,其特征在于:假微型海链藻(Thalassiosirapseudonana)壳面锚定溶菌酶表达载体构建方法,该方法包括以下步骤:
(1)基础质粒的构建:参照序列1构建基础质粒pLJ01;
(2)密码子偏好性设计:根据假微型海链藻的密码子偏好性,对原始溶菌酶的基因序列进行改造,在不改变溶菌酶氨基酸序列的基础上设计适合假微型海链藻表达的溶菌酶基因序列(序列4);
(3)壳面锚定溶菌酶表达载体的构建:将硅藻特有启动子Tpfcp8promoter(序列5)、相应抗性筛选标记基因NourseothricinN-acetyl-transferasegene(序列6)和特有终止子Tpfcp8terminator(序列7)按顺序插入到pLJ01的多克隆位点-1位置上;将硅藻特有启动子Tpfcp8promoter、锚定蛋白基因序列Sil3(序列8)、功能基因表达序列、荧光筛选标记基因EGFP(序列9)和特有终止子Tpfcp8terminator按顺序插入到pLJ01的多克隆位点-2位置上,获得最终的假微型海链藻壳面锚定溶菌酶表达载体pLJ02(序列10)。
3.一种表达壳面锚定蛋白硅藻的遗传转化方法及鉴定方法,其特征在于:将壳面锚定蛋白表达载体导入受体硅藻中,经筛选和鉴定得到能够表达壳面锚定蛋白的转基因硅藻,包括以下步骤:
(1)藻细胞的准备:选用生长迅速,稳定性良好的硅藻作为受体藻,用无菌的藻类特定培养基培养至对数生长期;
(2)硅藻壳面锚定蛋白表达载体的导入:分别采用玻璃珠转化法、基因枪法或电转法将构建好的硅藻壳面锚定蛋白表达载体转入受体硅藻中;
(5)转化硅藻的筛选与鉴定:采用抗性平板对遗传转化硅藻进行筛选,并进行基因测序和表达产物分析,确定表达壳面锚定蛋白的转基因硅藻藻株。
4.如权利要求3所述的表达壳面锚定蛋白的硅藻的转化方法及鉴定方法,其特征在于选用假微型海链藻作为受体藻,转入壳面锚定溶菌酶表达载体,经筛选和鉴定得到能够表达壳面锚定溶菌酶的转基因硅藻,其具体步骤如下:
(1)藻细胞的准备:采用假微型海链藻(Thalassiosirap...
【专利技术属性】
技术研发人员:冯超,李静,陈西广,张凯超,
申请(专利权)人:中国海洋大学,
类型:发明
国别省市:山东;37
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