一种培育抗大豆花叶病毒的大豆的方法技术

本发明专利技术公开了一种培育抗大豆花叶病毒的大豆的方法。本发明专利技术以SMV HC‑Pro基因作为靶标基因，对国内外SMV流行株系进行多重核苷酸序列比对，在保守区间内确定了gRNA靶点序列，构建了CRISPR/Cas9基因组定点编辑载体，进一步应用农杆菌介导大豆子叶节的遗传转化体系，获得一批阳性转基因材料，通过SMV抗病鉴定、qRT‑PCR、DAS‑ELISA血清学实验，分别从表型水平、RNA水平和蛋白水平研究了T

A method of breeding soybean resistant to soybean mosaic virus

【技术实现步骤摘要】
一种培育抗大豆花叶病毒的大豆的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种培育抗大豆花叶病毒的大豆的方法。
技术介绍
由大豆花叶病毒(Soybeanmosaicvirus，SMV)引起的大豆花叶病毒病是一种全球性大豆病害，广泛分布于世界各大豆产区，严重影响大豆的产量和品质。SMV属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)，马铃薯Y病毒属(Potyvirus)，大豆花叶病毒种。大豆感染SMV后，会产生花叶和坏死等症状，造成大豆光合面积减少和光合能力降低，植株矮化，生长量下降，籽粒出现褐斑，造成大豆产量损失约35％-50％，甚至绝收。CRISPR/Cas9技术是近年新兴起的一种高效、精准、特异的基因组靶向修饰技术，能够利用序列特异性核酸酶实现基因组的靶向切割和特定位点的插入、缺失、突变或替换，为基因功能的鉴定、作物性状的定向改良提供了新的有效手段。近些年来，科学家们已经成功地将CRISPR/Cas9技术应用于大豆研究当中，包括敲除外源绿色荧光蛋白基因(gfp)和除草剂抗性基因(bar)，敲除内源功能基因(如GmFEI2、GmSHR、GmFT2a、GmPDS11或GmPDS18)，开发快速识别大豆基因组中靶位点及限制性酶切位点的在线网络工具等。但上述研究均未涉及大豆花叶病毒病抗性的改良。
技术实现思路
本专利技术的目的是提高大豆对大豆花叶病毒的抗性。本专利技术首先保护一种培育抗大豆花叶病毒的大豆的方法，可为使大豆含有CRISPR-Cas9系统；所述CRISPR-Cas9系统中含有sgRNA；所述sgRNA识别的靶标可为大豆花叶病毒的HC-Pro基因。上述方法中，所述使大豆含有CRISPR-Cas9系统具体可通过向大豆中导入含有CRISPR-Cas9系统的载体实现。上述方法中，所述大豆可为大豆花叶病毒感病品种。上述方法中，所述大豆具体可为大豆品种Jack。上述方法中，所述sgRNA识别的靶标具体可为大豆花叶病毒的HC-Pro基因的保守区。所述大豆花叶病毒的HC-Pro基因的保守区具体可为大豆花叶病毒的HC-Pro基因自5’末端起第2039-2309位(图1所示)或第8373-8530位(图2所示)。上述方法中，所述sgRNA识别的靶位点可为序列表中序列1或序列表中序列2所示的DNA分子。上述方法中，所述CRISPR-Cas9系统还可含有Cas9蛋白的编码基因。本专利技术还保护一种含有sgRNA的CRISPR-Cas9系统；所述sgRNA识别的靶标可为大豆花叶病毒的HC-Pro基因。上述CRISPR-Cas9系统中，所述sgRNA识别的靶标具体可为大豆花叶病毒的HC-Pro基因的保守区。所述大豆花叶病毒的HC-Pro基因的保守区具体可为大豆花叶病毒的HC-Pro基因自5’末端起第2039-2309位(图1所示)或第8373-8530位(图2所示)。上述CRISPR-Cas9系统中，所述sgRNA识别的靶位点可为序列表中序列1或序列表中序列2所示的DNA分子。上述CRISPR-Cas9系统中，所述CRISPR-Cas9系统还可含有Cas9蛋白的编码基因。所述CRISPR-Cas9系统具体可为含有CRISPR-Cas9系统的载体。上文中，所述大豆花叶病毒的株系可为a1)至a13)中的至少一个；a1)SMVSC3株系(Genebank登录号为JF833013)；a2)SMVG2株系(Genebank登录号为S42280)；a3)SMVG3株系(Genebank登录号为FJ640978)；a4)SMVG4株系(Genebank登录号为FJ640979)；a5)SMVG6株系(Genebank登录号为FJ640980)；a6)SMVG7株系(Genebank登录号为AF241739)；a7)SMVN株系(Genebank登录号为D00507)；a8)SMVG1株系(Genebank登录号为FJ640977)；a9)SMVSC6株系(Genebank登录号为HM590054)；a10)SMVSC15(6067-1)株系(Genebank登录号为JF833015)；a11)SMVSC21(6202-2)株系(Genebank登录号为JF833014)；a12)SMVHH5株系(Genebank登录号为AJ310200)；a13)SMVHZ株系(Genebank登录号为AJ312439)。上文中，所述含有CRISPR-Cas9系统的载体具体可为实施例提及的重组质粒Cas9-HCss(+)。重组质粒Cas9-HCss(+)具体可为oligo二聚体甲和Cas9/gRNAVector发生同源重组获得。Cas9/gRNAVector可为植物Cas9/gRNA质粒构建试剂盒中的组件。植物Cas9/gRNA质粒构建试剂盒具体可为北京唯尚立德生物科技有限公司的产品，货号为VK005-15。oligo二聚体甲可由HCss(+)-F：5’-TTGTCTTTAGCTATGTACATCCT-3’和HCss(+)-R：5’-AACAGGATGTACATAGCTAAAGA-3’退火形成。上文中，所述含有CRISPR-Cas9系统的载体具体可为实施例提及的重组质粒Cas9-HCss(-)。重组质粒Cas9-HCss(-)具体可为oligo二聚体乙和所述Cas9/gRNAVector发生同源重组获得。ligo二聚体乙可由HCss(-)-F：5’-TTGCATGTGGAGAATCATGAATG-3’和HCss(-)-R：5’-AACCATTCATGATTCTCCACATG-3’退火形成。上文中，所述大豆花叶病毒的HC-Pro基因具体可为D1)至D13)中的至少一个；D1)SMVSC3株系的HC-Pro基因；D2)SMVG2株系的HC-Pro基因；D3)SMVG3株系的HC-Pro基因；D4)SMVG4株系的HC-Pro基因；D5)SMVG6株系的HC-Pro基因；D6)SMVG7株系的HC-Pro基因；D7)SMVN株系的HC-Pro基因；D8)SMVG1株系的HC-Pro基因；D9)SMVSC6株系的HC-Pro基因；D10)SMVSC15(6067-1)株系的HC-Pro基因；D11)SMVSC21(6202-2)株系的HC-Pro基因；D12)SMVHH5株系的HC-Pro基因；D13)SMVHZ株系的HC-Pro基因。本专利技术还保护上述任一所述的CRISPR-Cas9系统在培育抗大豆花叶病毒的大豆中的应用。本专利技术还保护上述任一所述的CRISPR-Cas9系统在提高大豆对大豆花叶病毒的抗性中的应用。上述任一所述的方法或上述任一所述的CRISPR-Cas9系统在大豆育种的应用也属于本专利技术的保护范围。本专利技术以SMVHC-Pro基因作为靶标基因，对国内外SMV流行株系进行多重核苷酸序列比对，在保守区间内确定了gRNA靶点序列，构建了CRISPR/Cas9基因组定点编辑载体，进一步应用农杆菌介导大豆子叶节的遗传转化体系，获得一批本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种培育抗大豆花叶病毒的大豆的方法，为使大豆含有CRISPR-Cas9系统；所述CRISPR-Cas9系统中含有sgRNA；/n所述sgRNA识别的靶标为大豆花叶病毒的HC-Pro基因。/n

【技术特征摘要】
1.一种培育抗大豆花叶病毒的大豆的方法，为使大豆含有CRISPR-Cas9系统；所述CRISPR-Cas9系统中含有sgRNA；
所述sgRNA识别的靶标为大豆花叶病毒的HC-Pro基因。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述sgRNA识别的靶位点为序列表中序列1或序列表中序列2所示的DNA分子。


3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述CRISPR-Cas9系统还含有Cas9蛋白的编码基因。


4.如权利要求1至3所述的方法，其特征在于：所述大豆花叶病毒的株系为a1)至a13)中的至少一个；a1)SMVSC3株系；a2)SMVG2株系；a3)SMVG3株系；a4)SMVG4株系；a5)SMVG6株系；a6)SMVG7株系；a7)SMVN株系；a8)SMVG1株系；a9)SMVSC6株系；a10)SMVSC15(6067-1)株系；a11)SMVSC21(6202-2...

【专利技术属性】
技术研发人员：高乐，侯文胜，韩天富，孙石，吴存祥，蒋炳军，陈莉，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11