本发明专利技术属于酶工程技术领域，尤其是涉及一种CK‑MB型肌酸激酶同工酶、制备方法及应用。通过本发明专利技术所提供的制备方法所得到的CK‑MB型肌酸激酶同工酶的产率较高，M亚基蛋白和B亚基蛋白等比例复性后的得率为35 mg/L；通过本发明专利技术的制备方法所得到的CK‑MB型肌酸激酶同工酶用罗氏肌酸激酶同工酶检测试剂盒（电化学发光法）进行定量检测，其活性率大于41%。本发明专利技术所提供的CK‑MB型肌酸激酶同工酶的制备方法操作简单、成本低、产率高，所制备得到的CK‑MB型肌酸激酶同工酶的生物活性高，稳定性好，可以用于体外诊断中质控品或者校准品，也可以用作免疫原或者筛选原用于肌酸激酶同工酶抗体开发。
A CK-MB creatine kinase isoenzyme, preparation method and Application
【技术实现步骤摘要】
一种CK-MB型肌酸激酶同工酶、制备方法及应用
本专利技术属于酶工程
，尤其是涉及一种CK-MB型肌酸激酶同工酶、制备方法及应用。
技术介绍
肌酸激酶同工酶为二聚体酶，广泛存在于各种组织中，分子量大小为81-82KDa，由两个相同或相似的亚基组成，包括肌肉型(CK-MM)、脑型(CK-BB)、杂化型(CK-MB)、线粒体型(MiMi)四种。其中，CK-MB型肌酸激酶同工酶诊断特异性最高，在急性心肌梗死(AMI)发生6h后，含量升至正常浓度的2倍，24h后达峰值，36h后降至基线水平，心梗发生时，血清CK-MB的浓度可增高至正常水平的10-25倍，超过CK总活力的10-12倍，临床上CK-MB被视为检测AMI的“金标准”。CK-MB型肌酸激酶同工酶的空间结构极其复杂，体外重组表达困难。目前市面上高品质的CK-MB型肌酸激酶同工酶均为血源型。但因来源受限价格昂贵，严重阻碍CK-MB型肌酸激酶同工酶诊断产品的研究与开发。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于，针对现有技术中存在的不足，提供一种CK-MB型肌酸激酶同工酶的制备方法。为此，本专利技术的上述目的通过以下技术方案来实现：一种CK-MB型肌酸激酶同工酶的制备方法，所述CK-MB型肌酸激酶同工酶的制备方法包括如下步骤：(1)以优化后的人源化肌酸激酶同工酶基因为模板，基因序列为SEQIDNO.1，以基因序列为SEQIDNO.3、SEQIDNO.4的基因为引物进行PCR扩增，得到M亚基基因片段；以优化后的人源化肌酸激酶同工酶基因为模板，基因序列为SEQIDNO.2，以基因序列为SEQIDNO.5、SEQIDNO.6的基因为引物进行PCR扩增，得到B亚基基因片段；上述所用基因的基因序列如下所示：SEQIDNO.1：SEQIDNO.2：SEQIDNO.3：cagcaaatgggtcgcggatccATGCCGTTCGGTAACACCCSEQIDNO.4：gtggtggtggtggtgctcgagTTTCTGAGCCGGGATCATGTSEQIDNO.5：cagcaaatgggtcgcggatccATGCCGTTCTCTAACTCTCACAACGSEQIDNO.6：gtggtggtggtggtgctcgagTTTCTGAGCCGGCATCAGG(2)将M亚基基因片段、B亚基基因片段分别插入至表达载体pET28a(+)，形成pET28a-CKM与pET28a-CKB；(3)将pET28a-CKM与pET28a-CKB分别热激法转化表达宿主菌，并用IPTG诱导表达，然后离心分离菌体，超声破碎，并过Ni2+-NTA柱纯化目的蛋白，分别得到高纯度的M亚基蛋白和B亚基蛋白；(4)将高纯度的M亚基蛋白和B亚基蛋白稀释后等比例混合，形成CK-MB型肌酸激酶同工酶二聚体蛋白。在采用上述技术方案的同时，本专利技术还可以采用或者组合采用以下进一步的技术方案：优选地，步骤(2)中：分别以限制性内切酶BamHI和HindIII对表达载体pET28a(+)进行双酶切，将M亚基基因片段和B亚基基因片段分别与pET28a(+)酶切载体相连接。优选地，表达宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)或者Rosetta(DE3)。优选地，步骤(2)中应用DH5α感受态细胞进行载体构建，其目的在于增加筛选成功连接载体的概率。优选地，步骤(4)中：高纯度的M亚基蛋白和B亚基蛋白分别稀释至0.5mg/L，且以等比例混合，并在25℃下静置24h，形成CK-MB型肌酸激酶同工酶二聚体蛋白。本专利技术的第二个目的在于，针对现有技术中存在的不足，提供一种CK-MB型肌酸激酶同工酶。为此，本专利技术的上述目的通过以下技术方案来实现：一种CK-MB型肌酸激酶同工酶，所述CK-MB型肌酸激酶同工酶由前面所述的CK-MB型肌酸激酶同工酶的制备方法制备得到。本专利技术的第三个目的在于，针对现有技术中存在的不足，提供一种CK-MB型肌酸激酶同工酶在质控品或校准品中的应用。为此，本专利技术的上述目的通过以下技术方案来实现：一种CK-MB型肌酸激酶同工酶在质控品或校准品中的应用，所述CK-MB型肌酸激酶同工酶在质控品或校准品中的应用基于前文所述的CK-MB型肌酸激酶同工酶。在采用上述技术方案的同时，本专利技术还可以采用或者组合采用以下进一步的技术方案：优选地，以小牛血清作为稀释液将CK-MB型肌酸激酶稀释，并在真空条件下-45℃预冻，再真空冻干，形成冻干粉。优选地，稀释液的配方为：4％乳糖、1％BSA、2mMEDTA、50mMNaCl、0.02％叠氮钠。本专利技术还有一个目的在于，针对现有技术中存在的不足，提供一种CK-MB型肌酸激酶同工酶在肌酸激酶同工酶抗体开发中的应用。为此，本专利技术的上述目的通过以下技术方案来实现：一种CK-MB型肌酸激酶同工酶在肌酸激酶同工酶抗体开发中的应用，将前面所述的CK-MB型肌酸激酶同工酶用作免疫原或者筛选原用于肌酸激酶同工酶抗体开发。本专利技术提供一种CK-MB型肌酸激酶同工酶、制备方法及应用，通过本专利技术所提供的CK-MB型肌酸激酶同工酶的制备方法所得到的CK-MB型肌酸激酶同工酶的产率较高，M亚基蛋白和B亚基蛋白等比例复性后的得率为35mg/L；通过CK-MB型肌酸激酶同工酶的制备方法所得到的CK-MB型肌酸激酶同工酶用罗氏肌酸激酶同工酶检测试剂盒(电化学发光法)进行定量检测，其活性率大于41％；将所制备得到的CK-MB型肌酸激酶同工酶溶于牛血清并经真空干燥的得到的冻干粉可用作质控品或者校准品，该冻干粉在37℃可稳定保存11天以上，在4℃可稳定保存1年，复溶后4℃可稳定保存12天。本专利技术所提供的CK-MB型肌酸激酶同工酶的制备方法操作简单、成本低、产率高，所制备得到的CK-MB型肌酸激酶同工酶的生物活性高，稳定性好，可以用于体外诊断中质控品或者校准品，也可以用作免疫原或者筛选原用于肌酸激酶同工酶抗体开发。附图说明图1为用BamHI和XhoI双酶切构建的pET28-CKM与pET28-CKB；其中，M：DNAmarkerDL2000；1：为pET28a-CKM双酶切；2：为pET28a-CKB双酶切。图2为纯化后的M亚基蛋白、B亚基蛋白及复性后的CK-MB产品蛋白的SDS-PAGE电泳图，非还原；其中，MW：蛋白分子量标准(分别为20kD、34kD、50kD、80kD、110kD)；M：纯化后的M亚基蛋白(约43KD)；B：纯化后的B亚基蛋白(约43KD)；MB：复性后的CK-MB蛋白(约86KD)。具体实施方式参照附图和具体实施例对本专利技术作进一步详细地描述。1.肌酸激酶M亚基与B亚基表达载体的构建利用OptimumGeneTM基因设计软件优化人源化肌酸激酶同工酶两亚基编本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种CK-MB型肌酸激酶同工酶的制备方法，其特征在于，所述CK-MB型肌酸激酶同工酶的制备方法包括如下步骤：/n（1）以优化后的人源化肌酸激酶同工酶基因为模板，基因序列为SEQ ID NO.1，以基因序列为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4的基因为引物进行PCR扩增，得到M亚基基因片段；/n以优化后的人源化肌酸激酶同工酶基因为模板，基因序列为SEQ ID NO.2，以基因序列为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6的基因为引物进行PCR扩增，得到B亚基基因片段；/n（2）将M亚基基因片段、B亚基基因片段分别插入至表达载体pET28a (+)，形成pET28a-CKM与pET28a-CKB；/n（3）将pET28a-CKM与pET28a-CKB分别热激法转化表达宿主菌，并用IPTG诱导表达，然后离心分离菌体，超声破碎，并过Ni
【技术特征摘要】
1.一种CK-MB型肌酸激酶同工酶的制备方法，其特征在于，所述CK-MB型肌酸激酶同工酶的制备方法包括如下步骤：
（1）以优化后的人源化肌酸激酶同工酶基因为模板，基因序列为SEQIDNO.1，以基因序列为SEQIDNO.3、SEQIDNO.4的基因为引物进行PCR扩增，得到M亚基基因片段；
以优化后的人源化肌酸激酶同工酶基因为模板，基因序列为SEQIDNO.2，以基因序列为SEQIDNO.5、SEQIDNO.6的基因为引物进行PCR扩增，得到B亚基基因片段；
（2）将M亚基基因片段、B亚基基因片段分别插入至表达载体pET28a(+)，形成pET28a-CKM与pET28a-CKB；
（3）将pET28a-CKM与pET28a-CKB分别热激法转化表达宿主菌，并用IPTG诱导表达，然后离心分离菌体，超声破碎，并过Ni2+-NTA柱纯化目的蛋白，分别得到高纯度的M亚基蛋白和B亚基蛋白；
（4）将高纯度的M亚基蛋白和B亚基蛋白稀释后等比例混合，形成CK-MB型肌酸激酶同工酶二聚体蛋白。
2.根据权利要求1所述的CK-MB型肌酸激酶同工酶的制备方法，其特征在于，步骤（2）中：分别以限制性内切酶BamHI和HindIII对表达载体pET28a(+)进行双酶切，将M亚基基因片段和B亚基基因片段分别与pET28a(+)酶切载体相连接。
3.根据权利要求1所述的CK-MB型肌酸激酶同工酶的制备方法，其特征在于，表达宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)或者Rosetta(DE3)。
【专利技术属性】
技术研发人员：邓春泉，吴配配，李因来，周旭一，
申请(专利权)人：杭州博茵生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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