人GDF-15抗原表位肽、抗原、抗体、试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术公开了人GDF

【技术实现步骤摘要】
人GDF
‑
15抗原表位肽、抗原、抗体、试剂盒及应用


[0001]本专利技术涉及体外诊断
，具体为人GDF
‑
15抗原表位肽、抗原、抗体、试剂盒及应用。
[0002]具体涉及人生长分化因子15(GDF
‑
15)抗原表位肽、用该抗原表位肽制备的GDF
‑
15重组蛋白和特异性单克隆抗体、所述抗体在制备人GDF
‑
15体外诊断试剂盒上的应用、人GDF
‑
15体外诊断试剂盒、以及该试剂盒在定量检测血清中的人GDF
‑
15蛋白中的应用。

技术介绍

[0003]生长分化因子15(GDF
‑
15)，是转化生长因子p(TGF
‑
p)超家族的一员，成熟的GDF
‑
15是以二硫键结合的同源二聚体，是一种分泌型应激性蛋白，在心血管疾病的检测和治疗、炎症反应、癌症治疗和神经元的保护等生理病理过程中发挥重要作用。
[0004]在正常情况下，GDF
‑
15在心脏中有微量表达，但是在心肌缺血、心衰和动脉粥样硬化等情况下，GDF
‑
15会在心肌细胞中大量表达。研究表明血清中GDF
‑
15的浓度与多种心血管不良事件密切相关，对心力衰竭、急性心肌梗死、急性冠脉综合征等疾病的早期预测和预后风险提示有较高的价值，是为数不多的极具潜力的心血管疾病生物标志物。
[0005]近年来大量临床研究表明，GDF
‑
15也可以作为是冠心病死亡率的独立预测标记物，已用于对ACS患者进行危险分层。快速、准确的危险分层对于心血管疾病患者的诊疗具有重要意义，有助于医生根据不同危险分层选择合适的个体化干预措施与诊疗方案，助力优化患者预后、减轻医疗负担。
[0006]目前全球市场上检测GDF
‑
15厂家仅有罗氏一家，且国内尚未注册，寻找合适的具有免疫原性的GDF
‑
15抗原表位肽、制备特异性的GDF
‑
15重组蛋白及单克隆抗体、开发GDF
‑
15体外诊断试剂盒即成了重点。

技术实现思路

[0007]为解决免疫学检测人GDF
‑
15不足之处，通过设计人GDF
‑
15抗原表位肽，制备人GDF
‑
15免疫原、特异性GDF
‑
15重组蛋白及单克隆抗体，其在制备人GDF
‑
15试剂盒上的应用，人GDF
‑
15体外诊断试剂盒，以及该试剂盒在定量检测血清中的人GDF
‑
15蛋白中的应用。
[0008]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种抗人GDF
‑
15特异性抗体的制备方，包括以下步骤：
[0009]步骤S101：以人GDF
‑
15蛋白为靶抗原，分析并筛选两个优势抗原表位，氨基酸序列与小鼠无明显同源性。
[0010]步骤S102：为增强免疫效果，将所选择的两个抗原表位肽偶联载体蛋白，用其免疫小鼠。
[0011]步骤S103：为获得特异性的人GDF
‑
15单克隆抗体筛选物，将所选择的两个抗原表位肽分别通过柔性肽连接后重复三次，形成重组人GDF
‑
15蛋白氨基酸序列。
[0012]步骤S104：为提高该重组蛋白表达量，采用大肠杆菌偏爱密码子，将重组蛋白氨基
酸序列转换为对应的核苷酸序列。
[0013]步骤S105：化学合成上一步骤得到的核苷酸序列，并通过酶切连接，将合成得到的核苷酸片段插入表达载体PET
‑
20b，构建重组人GDF
‑
15蛋白表达载体。
[0014]步骤S106：重组人GDF
‑
15蛋白表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得到重组蛋白表达菌株，大规模培养后收集细胞，超声破碎离心后取上清过镍琼脂糖亲和层析柱亲和层析，纯化重组人GDF
‑
15蛋白。
[0015]步骤S107：用偶联载体蛋白抗原表位肽多次免疫Balb/c小鼠后，取其脾脏细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合，使用重组人GDF
‑
15蛋白多轮筛选，最终得到分泌人GDF
‑
15单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[0016]步骤S108：将杂交瘤细胞株分别制备Balb/c小鼠腹水，使用Protein A亲和层析法纯化单克隆抗体。
[0017]步骤S109：DAS
‑
ELISA确定C75单抗包被与D92单抗标记配对为最佳检测人GDF
‑
15组合。
[0018]步骤S110：并使用生物素放大系统，建立测定血清人GDF
‑
15的含量检测方法，具有较强的特异性和较高的灵敏度，检测范围到达16.08～2500pg/mL。
[0019]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0020]本专利技术的试剂盒可有效且特异性地检测血清中的GDF
‑
15含量，从而检测出心力衰竭患者和正常人之间的GDF
‑
15含量差异，由此可在心力衰竭和其他心血管疾病中发挥辅助诊断作用，具有广阔的市场前景。
附图说明
[0021]图1为本专利技术GDF
‑
15优势抗原表位肽(1)；
[0022]图2为本专利技术GDF
‑
15优势抗原表位肽(2)；
[0023]图3为本专利技术重组人GDF
‑
15蛋白氨基酸序列；
[0024]图4为本专利技术重组人GDF
‑
15蛋白核苷酸序列；
[0025]图5为本专利技术标准品浓度和对应的吸光度(OD)值的折线图。
具体实施方式
[0026]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0027]实施例1：
[0028]人GDF
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15优势抗原表位肽的选择
[0029]人GDF
‑
15蛋白及其氨基酸序列是本领域已知的，可在NCBI数据库查询(NCBI登录号：NP_004855.2)，根据各氨基酸区段的亲水性、表面可接触性、抗原倾向性等大量的理论研究和实验摸索，最终筛选得到两个优势抗原表位肽。
[0030]GDF
‑
15优势抗原表位肽(1)包含人GDF
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15蛋白(NCBI登录号：NP_004855.2)第243至第255位的肽段，并在该肽段的C末端加上半胱氨酸，由此构本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.人GDF
‑
15抗原表位肽、抗原、抗体、试剂盒及应用，其特征在于：包括以下步骤:步骤S101：以人GDF
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15蛋白为靶抗原，分析并筛选两个优势抗原表位，氨基酸序列与小鼠无明显同源性。步骤S102：为增强免疫效果，将所选择的两个抗原表位肽偶联载体蛋白，用其免疫小鼠。步骤S103：为获得特异性的人GDF
‑
15单克隆抗体筛选物，将所选择的两个抗原表位肽分别通过柔性肽连接后重复三次，形成重组人GDF
‑
15蛋白氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的人GDF
‑
15抗原表位肽、抗原、抗体、试剂盒及应用，其特征在于：为提高该重组蛋白表达量，采用大肠杆菌偏爱密码子，将重组蛋白氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列。3.根据权利要求2所述的人GDF
‑
15抗原表位肽、抗原、抗体、试剂盒及应用，其特征在于：化学合成上一步骤得到的核苷酸序列，并通过酶切连接，将合成得到的核苷酸片段插入表达载体PET
‑
20b，构建重组人GDF
‑
15蛋白表达载体。4.根据权利要求1所述的人GDF
‑
15抗原表位肽、抗原、抗体、试剂盒及应用，其特征在于：重组人GDF
‑
1...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓春泉，王琼琼，陈慧，吴文杰，杨晓宁，李易，付裕，吴容英，周旭一，
申请(专利权)人：杭州博茵生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：