CsLYK基因及其编码蛋白在提高柑橘溃疡病抗性的应用制造技术

本发明专利技术公开了CsLYK基因及其编码蛋白在提高柑橘溃疡病抗性的应用。所述CsLYK基因的编码蛋白为柑橘LysM类受体蛋白磷酸激酶，命名为CsLYK蛋白，CsLYK基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；蛋白序列为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。本发明专利技术还保护一种柑橘抗细菌性溃疡病的育种方法，包括如下步骤：将一个柑橘LysM类受体蛋白磷酸激酶编码基因通过超表达载体整合到柑橘中，有效提高柑橘对细菌性溃疡病的抗性。本发明专利技术对于柑橘的抗溃疡病育种具有重大的应用价值，这将为柑橘溃疡病抗病遗传育种奠定基础，大力促进柑橘抗溃疡病基因工程的发展和应用。

Application of cslyk gene and its coding protein in improving the resistance of citrus canker

【技术实现步骤摘要】
CsLYK基因及其编码蛋白在提高柑橘溃疡病抗性的应用
本专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及一种CsLYK基因及其编码蛋白在提高柑橘溃疡病抗性的应用。
技术介绍
柑橘是我国南方第一大水果，也是全球重要的经济作物。然而，柑橘细菌性溃疡病(Citrusbacterialcanker，CBC)却严重阻碍了柑橘产业的健康发展(胡军华等，2015)。柑橘溃疡病是由黄单胞杆菌柑橘致病变种(Xanthomonascitrisubsp.citri，Xcc)引起，它起源于印度、爪哇等地(胡军华等，2015)。我国福建、湖南、广东等柑橘主产区受柑橘溃疡病侵害较为严重。溃疡病菌主要侵染柑橘叶片、枝梢、果实等，其中苗木、幼树受害较为严重(何秀玲等，2007)。病树会出现落叶、枯梢、树势衰弱以及落果等现象，严重的影响了柑橘的产量和品质。受到柑橘溃疡病危害的芸香科植物有几十种，其中绝大部分为经济栽培品种。有研究发现甜橙最易感病，其次是酸橙和柚类(袁承东等，1997；李敏等，2013)。目前全世界已经有30多个国家和地区将柑橘细菌性溃疡病列为重要的植物检疫对象。目前为控制柑橘溃疡病危害通常采取一种综合防治策略：其中以化学防治为主，生物防治为辅。但是由于化学防治措施对环境不友好，极易对环境造成污染，且需要投入大量的人力、物力，生物防治效果差，成本高，所以亟待通过培育抗病新品种来减少溃疡病带来的损失(陈力等，2008；朱雪梅等，2017)。在抗病育种方面一代代柑橘人进行了长期杂交育种，但由于杂交育种周期长使得育种效率低。随着分子生物学的兴起，人们开始从抗病基因工程方向对病原菌本身和植物的抗病防卫反应进行研究。基因工程手段也在抗溃疡病研究中进行了尝试(段敏杰等，2016；贾瑞瑞等，2017)，获得了一些对溃疡病有抗性的转基因材料。例如陈善春等获得了对柑橘溃疡病有抗性的转柞蚕抗菌肽D基因的锦橙、新会橙、脐橙株系(陈善春等，1996)。外源基因NLS，chit42，Xa21和PthA在转移至冰糖橙，椪柑和甜橙后对柑橘溃疡病具有抗性(Mendesetal，2010；Yangetal，2011)。Li的研究发现CsBZIP40是响应柑橘溃疡病侵染的一个重要的转录因子，并且猜测是通过SA途径影响柑橘品种的抗性(Lietal.，2017)。CsLOB1基因作为溃疡病病原基因PthA的靶蛋白，被认为是是柑橘溃疡菌的感病因子，使得植物对溃疡病更为敏感(Lietal，2014)，Peng等对柑橘溃疡病感病基因CsLOB1启动子进行CRISPR/Cas9靶向敲除从而获得了对柑橘溃疡病抗性提高的植株。细胞溶素基序(LysM)结构域存在于大多数动植物体中，其长度约为40个氨基酸(Buistetal.，2008；Zhangetal.，2009)。LysM类受体激酶(LysMreceptor-likekinase，LYK)是在植物中发现的一类重要的类受体激酶，在拟南芥中有4个，在水稻中有10个成员(Shiuetal.，2004；Lehti-Shiuetal.，2009)。大多数植物LysM蛋白都与病原菌几丁质和肽聚糖识别有关，LYKs在多种植物病害发生、与微生物共生过程中的重要作用已被证实：拟南芥中的LYKs能够与几丁质和肽聚糖直接结合，促进AtLYK1形成二聚体并将激活位于胞内的激酶结构域，从而将胞外信号传递到胞内，突变植株感病性明显增强(Liuetal.,2012)；水稻中的两个LYP(LYP4与LYP6)与PGN、几丁质均能结合，沉默二者中的任何一个都会削弱植株抗性(Liuetal.,2012)。大麦、苜蓿、番茄等作物中的一些含有LysM结构域的蛋白的抗病功能也陆续被鉴定(Tanakaetal.,2010；Fliegmannetal.,2011；Zengetal.,2011)由此可见，LYKs可能是病原菌相关基因，参与了植物抵御病原侵害的过程。利用LYKs基因进行抗病分子育种具有重大的潜力。目前，尚没有利用LYKs提高柑橘对柑橘细菌性溃疡病的抗性的研究和应用。
技术实现思路
本专利技术为提高柑橘对细菌性溃疡病的抗性提供一种新的选择，公开一种CsLYK基因及其编码蛋白在提高柑橘溃疡病抗性的应用。该应用是将一个柑橘LysM类受体蛋白磷酸激酶编码基因通过表达载体整合到柑橘中，有效提高柑橘对细菌性溃疡病的抗性，这对于柑橘的抗细菌性溃疡病育种具有重大的应用价值。专利技术人在柑橘抗感柑橘细菌性溃疡病后转录组中获得了一个在抗病品种中受柑橘溃疡病菌诱导上调的LYKs基因，而感病品种则表达变化不大。因此，构建超量表达载体通过农杆菌介导转化柑橘研究转化柑橘对柑橘细菌性溃疡病的抗性。本专利技术通过下述技术方案实现：CsLYK基因及其编码蛋白在提高柑橘溃疡病抗性的应用，所述CsLYK基因的编码蛋白为柑橘LysM类受体蛋白磷酸激酶，命名为CsLYK蛋白，CsLYK基因的核苷酸序列为(a1)或(a2)：(a1)SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；(a2)来源于柑橘且与(a1)具有95％以上同一性且编码所述CsLYK蛋白的核苷酸序列。进一步的，所述CsLYK蛋白为(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：(b1)氨基酸序列如SEQIDNo.2所示的蛋白质；(b2)在(b1)所述蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白；(b3)将(b1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与柑橘溃疡病抗病性相关的蛋白质；(b4)来源于柑橘且与(b1)具有98％以上同一性且与柑橘溃疡病抗病性相关的蛋白质。CsLYK基因及其编码蛋白在提高柑橘溃疡病抗性的应用，包括以下步骤：(1)克隆柑橘CsLYK编码序列，然后进行超量表达载体构建；(2)超量表达载体转化柑橘，得到溃疡病抗性提高的转基因植株。其中，步骤(1)中，克隆柑橘CsLYK基因编码序列所采用的PCR引物为OE-F和OE-R，分别具有如SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示核苷酸序列。进一步的，步骤(1)中，柑橘CsLYK基因编码序列的克隆方法为：提取柑橘总RNA，然后反转录为cDNA，最后采用高保真酶PCR扩增CsLYK基因编码序列DNA片段。进一步的，步骤(1)中，超量表达载体构建方法为：以pLGNe为载体，pLGNe载体带有CaMV35S启动子，CaMV35S启动子为花菜花叶病毒启动子，具有SEQIDNO.5所示的核苷酸序列，利用KpnⅠ和EcoRⅠ酶切目的片段后连接到KpnⅠ和EcoRⅠ酶切回收的载体上，构建超量表达载体pLGNe-LYK。进一步的，步骤(2)中，超量表达载体转化柑橘的方法为：超量表达载体通过电击法转化根癌农杆菌，再用根癌农杆菌介导转化柑橘外植体，遗传转化后的外植体细胞经离体培养、染色鉴定、嫁接后得到转基因植株。进一步的，步骤(2)得到转基因植株后，对转基因植株进行抗性评价，判定CsLYK基因超量表达可提高柑橘对细菌性溃疡病的抗性。进一步的，对转基因植株进行抗性评价前，通过PCR验证转本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.CsLYK基因及其编码蛋白在提高柑橘溃疡病抗性的应用，其特征在于，所述CsLYK基因的编码蛋白为柑橘LysM类受体蛋白磷酸激酶，命名为CsLYK蛋白，CsLYK基因的核苷酸序列为(a1)或(a2)：/n(a1)SEQ ID No.1所示核苷酸序列；/n(a2)来源于柑橘且与(a1)具有95％以上同一性且编码所述CsLYK蛋白的核苷酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.CsLYK基因及其编码蛋白在提高柑橘溃疡病抗性的应用，其特征在于，所述CsLYK基因的编码蛋白为柑橘LysM类受体蛋白磷酸激酶，命名为CsLYK蛋白，CsLYK基因的核苷酸序列为(a1)或(a2)：
(a1)SEQIDNo.1所示核苷酸序列；
(a2)来源于柑橘且与(a1)具有95％以上同一性且编码所述CsLYK蛋白的核苷酸序列。


2.根据权利要求1所述的CsLYK基因及其编码蛋白在提高柑橘溃疡病抗性的应用，其特征在于，所述CsLYK蛋白为(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：
(b1)氨基酸序列如SEQIDNo.2所示的蛋白质；
(b2)在(b1)所述蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白；
(b3)将(b1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与柑橘细菌性溃疡病抗病性相关的蛋白质；
(b4)来源于柑橘且与(b1)具有98％以上同一性且与柑橘溃疡病抗病性相关的蛋白质。


3.根据权利要求1所述的CsLYK基因及其编码蛋白在提高柑橘溃疡病抗性的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)克隆柑橘CsLYK编码序列，然后进行超量表达载体构建；
(2)超量表达载体转化柑橘，得到溃疡病抗性提高的转基因植株。


4.根据权利要求3所述的CsLYK基因及其编码蛋白在提高柑橘溃疡病抗性的应用，其特征在于，步骤(1)中，克隆柑橘CsLYK基因编码序列所采用的PCR引物为OE-F和OE-R，分别具有如SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示核苷酸序列。


5.根据权利要求3所述的CsLYK基因及其编码蛋白在提高柑橘溃疡病抗性的应用，其特征在于，步骤(1)中，柑橘CsLYK基因编码序列的克隆方法为：提取柑橘总RNA，然后反转录为cDNA，最后采用高保真酶PCR扩增CsLYK基因编码序列DNA片...

【专利技术属性】
技术研发人员：李强，祁静静，胡安华，何永睿，陈善春，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50