基于恒温催化反应过程中实时测定吸光度的酶活测定方法技术

本发明专利技术公开了一种基于恒温催化反应过程中实时测定吸光度的酶活测定方法。该方法包括：在待测酶恒温催化反应的同时实时测定反应体系吸光度；如吸光度随时间变化曲线为直线，则任意选择两个时间点测定的吸光度计算待测酶酶活；如包含直线部分，则选择此直线部分中任意两个时间点测定的吸光度计算待测酶酶活；如不为直线且不包含直线部分，则改变或优化测定条件，重新测定，直至变化曲线为直线或包含直线部分止；以上所有直线部分均至少有三个吸光度值且斜率不为零。本发明专利技术实现酶催化温度及时间的精确计量，简化操作。且以初始催化反应速率计算酶活，缩短检测时间，降低底物和待测酶液浓度，节省成本。该方法无终止催化反应操作，缩短检测总时间。

Enzyme activity determination method based on real-time absorbance measurement in constant temperature catalytic reaction process

【技术实现步骤摘要】
基于恒温催化反应过程中实时测定吸光度的酶活测定方法
本专利技术涉及酶活测定领域，具体涉及一种基于恒温催化反应过程中实时测定吸光度的酶活测定方法。
技术介绍
酶活是酶和酶制剂的挖掘、创制、研究、生产、分离纯化及应用的一个必不可少的参数，以其在特定的温度等试验条件下所催化的反应的速率表示。分光光度法是最常用的酶活测定技术，利用分光光度法测定酶活的过程，一般是将酶催化反应体系在某设定温度维持一定时间，然后用加热煮沸的方式灭酶或加入酶的抑制剂以终止反应，通过酶催化反应前后反应体系的吸光度(OD)的变化测定酶催化产物的生成量或酶催化底物的消耗量，进而计算得到酶活[MiyabeR,TakahashiY,MatsufujiH,OgiharaJ,ItouK,KawaiY,etal.PurificationandpartialcharacterizationofanX-prolyl-dipeptidylaminopeptidasefromLactobacillusgasseriME-284.FoodScienceandTechnologyResearch.2015；21(3):445-51.][MejiasL,CerdaA,BarrenaR,GeaT,SanchezA.Microbialstrategiesforcellulaseandxylanaseproductionthroughsolid-statefermentationofdigestatefrombiowaste.Sustainability.2018；https://doi.org/10.3390/su10072433.][AlhelliAM,AbdulManapMY,MohammedAS,MirhosseiniH,SulimanE,ShadZ,etal.Responsesurfacemethodologymodellingofanaqueoustwo-phasesystemforpurificationofproteasefromPenicilliumcandidum(PCA1/TT031)undersolidstatefermentationanditsbiochemicalcharacterization.InternationalJournalofMolecularSciences.2016；https://doi.org/10.3390/ijms17111872]。该方法由于仅测定催化反应前后两个时间点的吸光度值，我们称之为“两点法”。在这样的测定过程中，由于酶的催化反应过程与吸光度的检测在时间和空间上是相互分离的，即反应和检测不在同一容器中同时进行，导致操作复杂，且容易出现误差。酶催化的反应温度和反应时长的计量是酶活检测准确与否的重要影响因素。现有的“两点法”，酶催化反应体系在反应起始阶段的试剂混和与温度控制过程，在终止酶催化反应的阶段均存在较大的系统误差和偶然误差。具体表现是：在反应的起始阶段，酶催化反应的试剂溶液、待测酶液的温度一般是室温，而酶催化反应的设定温度多不是室温；上述多种液体混和形成反应体系，即开始了酶催化反应；混和而成的反应体系通常在水浴中需要一段时间才能达到设定温度；因此，酶催化反应开始的时间点不是达到设定催化温度的时间点。在终止反应阶段，不论是加热煮沸还是加入酶的抑制剂来终止酶催化反应，终止的操作过程均需消耗一段时间，因而也不能准确地确定反应终止的时间点。为了减少上述因素引起的误差，往往通过较高浓度的底物和较长的酶催化反应时长(通常控制在10～60min)，来减少计量误差的影响[MiyabeR,TakahashiY,MatsufujiH,OgiharaJ,ItouK,KawaiY,etal.PurificationandpartialcharacterizationofanX-prolyl-dipeptidylaminopeptidasefromLactobacillusgasseriME-284.FoodScienceandTechnologyResearch.2015；21(3):445-51.][MejiasL,CerdaA,BarrenaR,GeaT,SanchezA.Microbialstrategiesforcellulaseandxylanaseproductionthroughsolid-statefermentationofdigestatefrombiowaste.Sustainability.2018；https://doi.org/10.3390/su10072433.][AlhelliAM,AbdulManapMY,MohammedAS,MirhosseiniH,SulimanE,ShadZ,etal.Responsesurfacemethodologymodellingofanaqueoustwo-phasesystemforpurificationofproteasefromPenicilliumcandidum(PCA1/TT031)undersolidstatefermentationanditsbiochemicalcharacterization.InternationalJournalofMolecularSciences.2016；https://doi.org/10.3390/ijms17111872]。酶反应动力学的研究表明，在酶反应的最初阶段，底物或产物的变化量随反应时间的增加而呈线性增加，酶的催化反应速率最大，此时的酶的反应速率称为初始催化反应速率。随着反应时间的延长，底物的消耗速率或产物的生成速率下降，酶的催化反应速率下降。造成酶反应速率下降的因素很多，随着反应的延续，底物浓度不断降低，产物不断增加，逆向反应从无到有逐渐变得显著，同时酸、碱、热等因素也在慢慢地起作用，使酶破坏失活。因此，真正能代表酶的催化活性的只能是酶的初始催化反应速率[居乃琥.酶工程手册.北京：中国轻工业出版社；2011：172.]，是能用于酶催化活性比对的标准化的特征指标。而现行的“两点法”，只测定反应开始及结束时的底物或产物浓度，无法判断在反应过程中底物浓度是否一直处于使酶保持初始催化反应速率的浓度范围之内[HuHL,vandenBrinkJ,GrubenBS,WostenHAB,GuJD,deVriesRP.Improvedenzymeproductionbyco-cultivationofAspergillusnigerandAspergillusoryzaeandwithotherfungi.InternationalBiodeterioration&Biodegradation.2011；65(1):248-52.][AlbertoBatista-GarciaR,Balcazar-LopezE,Miranda-MirandaE,Sanchez-ReyesA,Cuervo-SotoL,Aceves-ZamudioD,etal.Characterizationoflignocellulolyticactivit本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于分光光度法测定酶活的方法，包括如下步骤：/n(1)在待测酶的恒温催化反应的同时对反应体系进行吸光度值的实时测定；/n(2)绘制吸光度值随时间的变化曲线；如果吸光度值随时间的变化曲线为一条斜率不变的直线，则任意选择两个时间点测定的吸光度值计算所述待测酶的酶活；如果吸光度值随时间的变化曲线中包含直线部分，则选择此直线部分中任意两个时间点测定的吸光度值计算所述待测酶的酶活；如果吸光度值随时间的变化曲线不为一条斜率不变的直线，且不包含直线部分，则改变或优化测定条件，重新进行步骤(1)，直至吸光度值随时间的变化曲线为一条斜率不变的直线或包含直线部分止；以上所有的所述直线部分均至少有三个吸光度值且斜率不为零。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于分光光度法测定酶活的方法，包括如下步骤：
(1)在待测酶的恒温催化反应的同时对反应体系进行吸光度值的实时测定；
(2)绘制吸光度值随时间的变化曲线；如果吸光度值随时间的变化曲线为一条斜率不变的直线，则任意选择两个时间点测定的吸光度值计算所述待测酶的酶活；如果吸光度值随时间的变化曲线中包含直线部分，则选择此直线部分中任意两个时间点测定的吸光度值计算所述待测酶的酶活；如果吸光度值随时间的变化曲线不为一条斜率不变的直线，且不包含直线部分，则改变或优化测定条件，重新进行步骤(1)，直至吸光度值随时间的变化曲线为一条斜率不变的直线或包含直线部分止；以上所有的所述直线部分均至少有三个吸光度值且斜率不为零。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述进行吸光度值的实时测定为至少测定3个时间点的吸光度值。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述直线或所述直线部分是在使所述待测酶保持初始催化反应速率的情况下所得。


4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述直线或所述直线部分对应的吸光度值是在反应体系中底物浓度在不低于使所述待测酶保持初始催化反应速率的最低浓度的情况下测定；和/或
步骤(2)中，所述直线或所述直线部分...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜文侠，田晓丽，张笑然，孙瑞雪，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12