一种利用LC-MS/MS高通量鉴别类胡萝卜素以及类胡萝卜素数据库建立方法技术

一种利用LC‑MS/MS高通量鉴别类胡萝卜素的方法以及类胡萝卜素数据库建立的方法，包括如下步骤：取组织样品冻干；在冻干的组织样品中加入碳酸氢钠，然后加入提取液进行色素提取得到上清液，冻干的组织样品与碳酸氢钠的质量比为1：(0.5～1)，提取液由正己烷：丙酮：无水乙醇按照体积比(1～3)：(1～2)：(1～2)混合制成；用质量分数为5％～10％的饱和NaCl水溶液对上清液进行多次清洗；取清洗后的上清液进行浓缩干燥得到类胡萝卜素样品；以得到的类胡萝卜素样品为测试对象，进行LC‑MS/MS检测，得到类胡萝卜素样品中各个类胡萝卜素的保留时间、质荷比以及二级质谱图。基于申请的方法，可以同时实现对植物体中存在的各种类胡萝卜素进行高通量，高灵敏度检测。

A method of high throughput identification of carotenoids by LC-MS / MS and establishment of carotenoid database

【技术实现步骤摘要】
一种利用LC-MS/MS高通量鉴别类胡萝卜素以及类胡萝卜素数据库建立方法
本专利技术属于类胡萝卜素鉴别
，具体涉及一种利用LC-MS/MS高通量鉴别类胡萝卜素的方法以及类胡萝卜素数据库建立方法。
技术介绍
类胡萝卜素(Carotenoids)是一类重要的植物色素，在自然界中，广泛存在于各种植物中，在动物及微生物中也有发现，类胡萝卜素种类很多，其中包括人们所熟知的α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、番茄红素等。到目前为止，已经鉴定的类胡萝卜素分子共有600多种，其中具有重要生物学功能的约有50几种。类胡萝卜素是光合生物进行光和作用必不可少的成分，在光合作用过程中起到两种作用：即光吸收和光保护；类胡萝卜素是一类能高效去除自由基的重要物质，类胡萝卜素分子可以与自由基起反应，形成无害的产物，或者通过破坏自由基的链反应，将自由基从体内清除掉，从而使基体细胞免受损伤。类胡萝卜素具有重要的生物学功能，人体自身不能合成类胡萝卜素，必须通过外界摄入，大量摄取各种类胡萝卜素，有益于人类健康，它们越来越受到人们关注。植物类的农产品中拥有丰富的天然类胡萝卜素资源，随着类胡萝卜素在制药、食品及饲料工业中的广泛应用，国内的许多研究机构、大专院校、商检部门和生产制造商都在进行胡萝卜素的分析工作。但是，一直缺乏一种可以广泛应用，高通量，高灵敏度的分析方法以满足多行业或企业的标准。
技术实现思路
本专利技术解决的技术问题为：提供一种利用LC-MS/MS高通量鉴别类胡萝卜素的方法以及类胡萝卜素数据库建立的方法，基于本申请的方法，可以同时实现对植物体中存在的各种类胡萝卜素进行高通量，高灵敏度检测。本专利技术提供了一种利用LC-MS/MS高通量鉴别类胡萝卜素的方法，包括如下步骤：1)取组织样品冻干；2)在冻干的组织样品中加入碳酸氢钠，加入提取液进行色素提取得到上清液，所述冻干的组织样品与所述碳酸氢钠的质量比为1：(0.5～1)，所述提取液由正己烷：丙酮：无水乙醇按照体积比(1～3)：(1～2)：(1～2)混合制成；3)用质量分数为5％～10％的饱和NaCl水溶液对所述上清液进行多次清洗；4)取清洗后的上清液进行浓缩干燥得到类胡萝卜素样品；5)以步骤4)得到的类胡萝卜素样品为测试对象，进行LC-MS/MS检测，得到类胡萝卜素样品中各个类胡萝卜素的保留时间、质荷比以及二级质谱图。根据本专利技术的方法具有如下技术效果：(1)提取方法上无需皂化，保留了类胡萝卜素的最真实状态，本申请将上述提取方法与LC-MS/MS结合实现了复杂样品中各类胡萝卜素的快速、准确的检测。(2)高通量，采用LC-MS/MS联用，通过质荷比进行扫描，可得到各类胡萝卜素二级质谱图，在同一时间可以测出上百种类的胡萝卜素。(3)具有广泛的适用性，通过LC-MS/MS联用可获取各类胡萝卜素的一级质谱和二级质谱数据以及色谱数据，通过上述数据可得到类胡萝卜素的质荷比、二级质谱子离子及保留时间，利用这些数据可对检测到的类胡萝卜素进行定性分析，基于本申请的方法可用于分析鉴定任何植物任何组织内的类胡萝卜素的种类。在上述方案的基础上，本专利技术还进行了如下改进：进一步，所述提取液由正己烷：丙酮：无水乙醇按照体积比2：1：1混合制成。目前，常采用的类胡萝卜素提取方法包括有机溶剂提取方法、皂化后提取法。皂化提取方法：破坏样品的组织细胞，提高类胡萝卜素的提取率；使非游离态的类胡萝卜素转变为游离态的类胡萝卜素，可以使类胡萝卜素完全释放出来，无法得到类胡萝卜素的最真实状态；有机溶剂提取方法：选择合适的溶剂或溶剂组合以及优化提取步骤是有效提取类胡萝卜素的关键因素，但由于不同的类胡萝卜素极性大小有很大的差异，没有一种溶剂或溶剂配比能适合所有样品中的类胡萝卜素。采用基于本申请的有机溶剂配比进行可提取得到植物中绝大多数的类胡萝卜素，经过实验发现，提取得到的各类胡萝卜素的含量、纯度均可达到LC-MS/MS检测要求。进一步，所述提取液中含有0.01％(v/v)二丁基羟基甲苯(BHT)。BHT稳定性高，抗氧化能力强，在提取液中加入BHT可以防止类胡萝卜素在提取过程中被氧化。进一步，步骤4)中浓缩干燥处理过程为：取清洗后的上清液加入硫酸钠粉末，然后在真空浓缩仪中30℃条件下干燥。硫酸钠粉末的加入可除去上清液中存在的水，加速样品的浓缩干燥。进一步，步骤1)中具体处理内容为：取组织样品于真空冷冻干燥仪中干燥5～7天。该条加下可除去样品中多余的水分，有利于后续类胡萝卜素的提取。进一步，步骤2)中色素提取的具体处理操作为：在所述冻干样品中，按照冻干样品、碳酸氢钠以及提取液1g：(0.5～1)g：15ml的配比加入碳酸氢钠和提取液，进行提取。进一步，步骤5)中检测的具体内容为：取步骤S3中得到的类胡萝卜素样品溶解于乙酸乙酯中，在-15～-20℃氮气条件下保存48小时，然后低温过滤得到滤液，将滤液在13000r/min条件下离心20-30min，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后上样检测。由此，氮气条件和低温条件下可防止类胡萝卜素氧化，保证上样检测结果的准确性。进一步，所述LC-MS/MS检测的色谱条件包括：色谱柱为C30YMC柱，柱温为35℃；流动相A：0.1％的甲酸溶液，溶剂由甲醇：甲基叔丁基醚：水溶液按照体积比81：15：4混合制成；流动相B：0.1％甲酸溶液，溶剂由甲醇：甲基叔丁基醚：水按照体积比16：80.4：3.6混合制成，梯度洗脱条件如下：0～30min，B：1％～34％；30～35min，B：34％；35～50min，B：34％～56％；50～70min，B：56％～78％；70～75min，B：78％～100％；75～80min，B：100％～1％；80～85min，B：1％；所述LC-MS/MS检测的紫外光谱检测条件包括：检测器为PDA检测器；检测波长为286、348和450nm；所述LC-MS/MS检测的质谱条件包括：质谱仪为Q-Exactive；离子源为APCI；质量分析器为四极杆和Orbitrap；检测器为Orbitrap；喷雾电压3200V；毛细管温度320℃；汽化器温度550℃；放电电流5.00μA；扫气流量0.02；质量扫描范围100～1400m/z。基于本申请的方法，采用上述色谱条件、液相条件和质谱条件，在无需皂化的条件下，仍然可以实现不同种类类胡萝卜素高效分离，并实现类胡萝卜素的高准确度、高灵敏度、高通量检测。本专利技术还提供了一种类胡萝卜素数据库建立方法，以上述方法得到的保留时间、质荷比、二级质谱子离子以及分析得到的对应的化合物结构为主要内容建立类胡萝卜素数据库。由此，以化合物结构、保留时间为、质荷比以及二级质谱子离子主要内容的本地代谢数据库，方便后续类胡萝卜素样品中的类胡萝卜素的检索分析。本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用LC-MS/MS高通量鉴别类胡萝卜素的方法，其特征在于包括如下步骤：/n1)取组织样品冻干；/n2)在冻干的组织样品中加入碳酸氢钠，然后加入提取液进行色素提取得到上清液，所述冻干的组织样品与所述碳酸氢钠的质量比为1：(0.5～1)，所述提取液由正己烷：丙酮：无水乙醇按照体积比(1～3)：(1～2)：(1～2)混合制成；/n3)用质量分数为5％～10％的饱和NaCl水溶液对所述上清液进行多次清洗；/n4)取清洗后的上清液进行浓缩干燥得到类胡萝卜素样品；/n5)以步骤4)得到的类胡萝卜素样品为测试对象，进行LC-MS/MS检测，得到类胡萝卜素样品中各个类胡萝卜素的保留时间、质荷比以及二级质谱图。/n

【技术特征摘要】
1.一种利用LC-MS/MS高通量鉴别类胡萝卜素的方法，其特征在于包括如下步骤：
1)取组织样品冻干；
2)在冻干的组织样品中加入碳酸氢钠，然后加入提取液进行色素提取得到上清液，所述冻干的组织样品与所述碳酸氢钠的质量比为1：(0.5～1)，所述提取液由正己烷：丙酮：无水乙醇按照体积比(1～3)：(1～2)：(1～2)混合制成；
3)用质量分数为5％～10％的饱和NaCl水溶液对所述上清液进行多次清洗；
4)取清洗后的上清液进行浓缩干燥得到类胡萝卜素样品；
5)以步骤4)得到的类胡萝卜素样品为测试对象，进行LC-MS/MS检测，得到类胡萝卜素样品中各个类胡萝卜素的保留时间、质荷比以及二级质谱图。


2.根据权利要求1所述的利用LC-MS/MS高通量鉴别类胡萝卜素的方法，其特征在于，所述提取液由正己烷：丙酮：无水乙醇按照体积比2：1：1混合制成。


3.根据权利要求1所述的利用LC-MS/MS高通量鉴别类胡萝卜素的方法，其特征在于，所述提取液中含有0.01％(v/v)BHT。


4.根据权利要求1所述的利用LC-MS/MS高通量鉴别类胡萝卜素的方法，其特征在于，步骤4)中浓缩干燥处理过程为：取清洗后的上清液加入硫酸钠粉末，然后在真空浓缩仪中30℃条件下干燥。


5.根据权利要求1所述的利用LC-MS/MS高通量鉴别类胡萝卜素的方法，其特征在于，步骤1)中具体处理内容为：取组织样品于真空冷冻干燥仪中干燥5～7天。


6.根据权利要求1所述的利用LC-MS/MS高通量鉴别类胡萝卜素的方法，其特征在于，步骤2)中色素提取的具体处理操作为：在所述冻干样品中，按照冻干样品、碳酸氢钠以及提取液1g：(0.5～1)g：15ml的配比加入碳酸氢钠和提取液，进行提取。

【专利技术属性】
技术研发人员：邓秀新，刘云，叶俊丽，贾聚金，李天，张正，曾云流，徐强，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42