一种干细胞生长因子原液的制备工艺方法技术

本发明专利技术公开了一种干细胞生长因子原液的制备工艺方法，本发明专利技术属于生物工程中的蛋白筛选浓缩技术领域,具体涉及Westernblot、透析及超滤技术获得高纯度蛋白质，并领用先进的导入技术，导入人类面部皮肤的真皮激活表皮再生及胶原蛋白的表达，达到面部除皱祛斑抗衰老的效果，利用Westernblot分子生物学实验技术定性检测干细胞培养基上清中是否含有bFGF、EGF、KGF蛋白，对培养基上清进行透析处理，根据生长因子EGF的分子量6KD，我们选择最大截留量为3500D的透析袋，选择透析脱水剂，我们选择PEG6000作为吸水剂，它在水中溶解性很大，被广泛应用于化妆品行列，该干细胞生长因子原液的制备工艺方法可以人体人体皮肤产生很好的影响，使皮肤变得红润，紧致，皱纹也显著的淡化。

A preparation method of stem cell growth factor stock solution

【技术实现步骤摘要】
一种干细胞生长因子原液的制备工艺方法
本专利技术属于生物工程中的蛋白筛选浓缩
，尤其设计一种干细胞生长因子原液的制备工艺方法。
技术介绍
干细胞再生因子原液是在人体干细胞培养过程中加以诱导，在传代过程中，选取最利于皮肤优化延缓衰老的时间点提取富含多种细胞活性因子的干细胞原液，经现代生物技术再处理制成原液，具有除皱、美白、淡斑、紧致等多种抗衰功效。随着研究的深入我们对于干细胞再生因子原液功能及作用机制产生了更多的思考，如它是否与肌肤修复密切相关，它是否对衰老起抑制作用，它是否能够促进角质层细胞生长和新陈代谢等等，而研究一种新的物质的功能,首先要研究如何获得该物质提取该物质的有效成分，以及如何使用该物质才是最有力的工具因此我们制备的干细胞生长因子原液及其使用方法，对于人类研究干细胞美容领域、抗衰老领域就有非常重要的作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是从人类脐带间充质干细胞通过胞外分泌途径分泌到培养基上清中的bFGF碱性成纤维细胞生长因子、EGF(表皮细胞生长因子)、(KGF)角质细胞生长因子进行浓缩纯化，并通过一种独特的方式导入皮肤的真皮层而发挥作用。本专利技术利用分子生物学技术，蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即WesternBlot方法检测不同干细胞代数培养基上清中bFGF、EGF、KGF的表达不同。我们选择选取最利于皮肤优化延缓衰老的时间点以后，收集培养基上清，因为我们的培养基上清中富含各种化合物(无水氯化钙、硝酸铁、氯化钾、无水硫酸镁、无水磷酸二氢钠、丁二酸、丁二酸钠、以及酚红等)，所以我们选择透析法基本平衡掉这些化合物，只剩下浓度较高的大分子蛋白质。由于脐带干细胞培养基上清的渗透压跟清洗液(0.09％生理盐水)的渗透压基本相同，所以单纯用透析法达不到浓缩及出掉大分子蛋白的目的，因此我们采用超滤离心的方法达到浓缩除掉大分子蛋白质的目的。相较现有技术，本专利技术的干细胞生长因子原液的制备工艺方法对于人类研究干细胞美容领域、抗衰老领域就有非常重要的作用，利用分子生物学技术，本专利技术很好的提供了对于干细胞生长因子原液的获取方法，以及如何使用该物质才是最有利的工具，干细胞生长因子原液的制备工艺方法选取最利于皮肤优化延缓衰老的时间点提取富含多种细胞活性因子的干细胞原液，经现代生物技术再处理制成原液，具有除皱、美白、淡斑、紧致等多种抗衰功效。附图说明图1是本专利技术细胞培养状态对比系统图。图2是本专利技术透析过程系统图。图3是本专利技术内培养基上清透析浓缩图。如下具体实施方式将结合上述附图进一步说明本专利技术。具体实施方式下面将结合附图对本专利技术作一具体介绍。一种干细胞生长因子原液的制备工艺方法，其步骤包括；S11第一步：利用Westernblot分子生物学实验技术定性检测干细胞培养基上清中是否含有bFGF、EGF、KGF蛋白，S12第二步：透析袋透析法，在生物大分子的制备过程中，除去盐、少量有机溶剂、生物小分子杂质和浓缩样品时都要用到透析的技术，根据生长因子EGF的分子量6KD，我们选择最大截留量为3500D的透析袋，S13第三步，透析脱水剂的选择，我们选择PEG6000作为吸水剂。所述步骤S11第一步：利用Westernblot分子生物学实验技术定性检测干细胞培养基上清中是否含有bFGF、EGF、KGF蛋白，1)SDS-PAGE凝胶电泳：细胞裂解液先进性超声，使细胞充分裂解，然后加6xSB后煮样10min，再经过10％(根据蛋白的大小选择不同的凝胶)的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。分别取20μg总蛋白上样，蛋白质分子量的标准品为5μL。电泳的初始电压值应该设置在80V之间，当染料(溴酚蓝)进入到分离胶之后，电压增加加到110V之间目的是保持所有的蛋白跑在同一水平线上，待溴酚蓝跑到琼脂糖凝胶电泳的最下方时电泳结束；2)转膜：待琼脂糖凝胶电泳(SDS-PAGE)结束后，将10％(一般情况下都用10％)的琼脂糖凝胶取出，并放置在电转缓冲液里平衡10－20min左右，PVDF膜必须在100％的甲醇中完全浸泡约15-30秒，用蒸馏水检验PVDF膜是否被激活(膜在水中游动说明已经被激活)，再将PVDF膜放入电转缓冲液中平衡，凝胶和聚偏二氟乙烯膜(PVDF)一起按照电转仪装置说明书的要求安装，以形成“三明治”结构，再放入电泳槽内，加入500ml电转液，在恒压(一般设在200V)条件下转膜约1.5h左右(根据蛋白大小确定转膜时间)，整个电转过程在自制的冰室中进行，目的是转膜过程中释放热量，而转膜需要保持低温；3)免疫反应：转膜结束后，将PVDF膜从电转缓冲液中捞出放入事先配置好的脱脂奶粉中(用TBST(20mMTirs，pH7.6，0.1％Tween，200.2MNaCl)配制的5％(W/V)的脱脂奶粉50ml)封闭，在室温下PVDF膜封闭大约1h或放在4度过夜，然后用TBST洗膜3次，每次10min，目的是出去结合在膜上的非特异性蛋白，再加入用脱脂奶粉稀释好的一抗(bFGF、EGF、KGF)，4℃条件下孵育过夜，用TBST缓冲液洗膜3次，每次5min，目的是除去非特异性结合的一抗，再以HRP标记的二抗(鼠源、兔源全式金)室温下孵育1h，用TBST缓冲液洗膜3次，每次10min；4)曝光：在暗室中，将配制好的ECLpluswesternblottingDetectionReagents工作液倒出备用，并且要按照说明书将A、B反应液(1：1)混匀后，迅速的加至PVDF膜上作用90s，用干净的滤纸吸去膜上的反应液，用保鲜膜包PVDF膜并放入曝光夹中，在膜上放比PVDF膜略微大的X-光片，立刻盖紧曝光夹，第一次曝光10秒，然后根据亮度调整曝光时间，取出X-光片，放于显影液里当胶片上清晰的显示出特异性的条带后，立即放入蒸馏水中目的是洗去显影液，然后在定影液中定影使X-光片变透明，最后图象的扫描，以备用于研究。分别收集上述培养基上清，P3代细胞状态稍微差的培养基上清记为A，P3代细胞状态好的培养基上清记为B，结果显示，以β-actin作为内对照，B中的各种蛋白因子显著高于A中的蛋白因子水平(如图1)，所述步骤S12第二步：透析袋透析法，在生物大分子的制备过程中，除去盐、少量有机溶剂、生物小分子杂质和浓缩样品时都要用到透析的技术，根据生长因子EGF的分子量6KD，我们选择最大截留量为3500D的透析袋，透析袋的使用方法如下：1).将透析管剪成适当长度(10-20cm)的小段，即成透析袋；2).在大体积的2％(m/v)碳酸氢钠和1mmol/LEDTA(PH＝8)中将透析袋煮沸10min；3).将透析袋用蒸馏水彻底漂洗；4).将透析袋置1mmol/LEDTA(PH＝8)中煮沸10min；5).透析袋冷却后存放于4度，应确保透析袋始终浸没在液体中；注:从此步起用透析袋时一定要戴手套操作；6).在使用之前要用蒸馏水将透析袋里外加以清洗；...

【技术保护点】
1.一种干细胞生长因子原液的制备工艺方法，其步骤包括；/n第一步：利用Westernblot分子生物学实验技术定性检测干细胞培养基上清中是否含有bFGF、EGF、KGF蛋白，/n第二步：透析袋透析法，在生物大分子的制备过程中，除去盐、少量有机溶剂、生物小分子杂质和浓缩样品时都要用到透析的技术，根据生长因子EGF的分子量6KD，我们选择最大截留量为3500D的透析袋，/n第三步，透析脱水剂的选择，我们选择PEG6000作为吸水剂。/n

【技术特征摘要】
1.一种干细胞生长因子原液的制备工艺方法，其步骤包括；
第一步：利用Westernblot分子生物学实验技术定性检测干细胞培养基上清中是否含有bFGF、EGF、KGF蛋白，
第二步：透析袋透析法，在生物大分子的制备过程中，除去盐、少量有机溶剂、生物小分子杂质和浓缩样品时都要用到透析的技术，根据生长因子EGF的分子量6KD，我们选择最大截留量为3500D的透析袋，
第三步，透析脱水剂的选择，我们选择PEG6000作为吸水剂。


2.根据权利要求1所述的一种干细胞生长因子原液的制备工艺方法，其特征在于：所述在第一步中，
1)SDS-PAGE凝胶电泳：首先将细胞进行超声裂解，然后加6xSB后煮样10min，再经过10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，分别取20μg总蛋白上样，蛋白质分子量的标准品为5μL，电泳的初始电压值设置在80V，当染料(溴酚蓝)进入到分离胶之后，电压增加加到110V，待溴酚蓝跑到琼脂糖凝胶电泳的最下方时电泳结束；
2)转膜：待琼脂糖凝胶电泳(SDS-PAGE)结束后，将10％的琼脂糖凝胶取出，并放置在电转缓冲液里平衡10－20min左右，PVDF膜必须在100％的甲醇中完全浸泡约15-30秒，用蒸馏水检验PVDF膜是否被激活，待膜在水中游动时，将PVDF膜放入电转缓冲液中平衡，凝胶和聚偏二氟乙烯膜(PVDF)一起按照电转仪装置说明书的要求安装，以形成“三明治”结构，再放入电泳槽内，加入500ml电转液，在恒压条件下转膜约1.5h。
3)免疫反应：转膜结束后，将PVDF膜从电转缓冲液中捞出放入事先配置好的脱脂奶粉中(用TBST(20mMTirs，pH7.6，0.1％Tween，200.2MNaCl)配制的5％(W/V)的脱脂奶粉50ml)封闭，在室温下PVDF膜封闭大约1h或放在4度过夜，然后用TBST洗膜3次，每次10min，再加入用脱...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈晓延，相爱玲，曲清梅，张欢，
申请(专利权)人：青岛西凯生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37