一种分泌型格氏环肽及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种分泌型格氏环肽及其制备方法。通过in‑fusion克隆技术，将格氏环肽（gassericin A）的相关合成基因按固定的串联方式重新组合获得

A secretory Grignard cyclic peptide and its preparation

【技术实现步骤摘要】
一种分泌型格氏环肽及其制备方法
本专利技术涉及一种乳酸菌环肽及其制备方法，属于生物
技术背景抗菌肽又名宿主防御肽，是生物体产生的与宿主防御和先天免疫相关的小分子多肽，一般由2-50个氨基酸组成。抗菌肽具有抑制杀灭病原体、促进免疫、促进伤口愈合和粘膜防御等功能。格氏环肽(gassericinA)主要是由格氏乳杆菌等乳杆菌属微生物分泌的一种环状细菌素类抗菌肽，由58个氨基酸残基组成，分子量为5652Da，其C端和N端通过酰胺键连接环化，对李斯特菌、蜡样芽孢杆菌、葡萄球菌等具有很强的抑制和杀灭作用，是潜在的抗生素替代品(Kawaietal.BiosciBiotechnolBiochem，1998，62:887–892)。由于其环状结构，性质稳定，其对热、胃液肠液等具有很好的耐受性(Tobaetal.LettApplMicrobiol，1991，13:281–286)。格氏环肽是一个包括转录翻译、运输、免疫、修饰等多个相关基因组成的基因簇gaaBCADITE(GenBank：AB007043)来合成，其中基因gaaA合成一个91个氨基酸组成的蛋白，N端为前导肽，当其穿过细胞膜后，切去N端33个氨基酸的前导肽后成为58个氨基酸残基组成的多肽(序列为：IYWIADQFGIHLATGTARKLLDAMASGASLGTAFAAILGVTLPAWALAAAGALGATA)；免疫基因gaaI编码的免疫蛋白可以防止格氏环肽的大量产生抑制或者杀灭宿主；基因gaaBCD与格氏环肽环化成熟相关(YasushiKawaietal.AppledandEnvironmentalMicrobiology，2009,75(5)：1324-1330)。野生型格氏乳杆菌分泌的格氏环肽受到培养方式、培养基成分的影响，其分泌量很少，而且培养成本高。目前，格氏环肽在大肠杆菌中实现胞内异源表达(Kawaietal.AnimalSciJ2003，74:45–51)，但表达产物为线性化的蛋白，活性差，而且稳定性差，容易被细菌自身的蛋白酶降解而无法实现高效表达(表达量只有370～480μg/L)，同时在大肠杆菌胞内表达，后处理提取需要破裂细胞，及其清除大肠杆菌内毒素等，实际生产工艺复杂，这些因素影响了其产业化。表达产物为线性化蛋白，活性差，且表达产物位于细胞内，需裂解细胞进行提取获得，工艺难度大，难以产业化。本专利替换gaaA位于N端的前导肽基因，gaaBC、gaaDI两个基因片段连接于gaaA下游，构建成格氏环肽表达盒，表达的格式环肽与野生型基因排列gaaBCADI不同，其排列方式为gaaABCDI，前导肽NprB-GaaA融合蛋白，在穿膜过程中切去前导肽，并在GaaBCD蛋白作用下环化，成功实现格氏环肽的高效分泌表达。GaaI蛋白是格氏环肽的免疫蛋白，保证宿主不被格式环肽杀死。采用In-fusion克隆技术将去除前导肽序列的gaaA与前导信号肽nprB序列连接(此序列形成NprB-GaaA融合蛋白)、再将gaaBC、gaaDI两个基因片段连接于gaaA下游，构建成格氏环肽表达盒，该表达盒置于强启动子的下游，将其导入基因工程菌可实现高效分泌表达。此表达盒形成的NprB-GaaA融合蛋白后，在胞内GaaBCD蛋白的作用下环化，然后在前导肽NprB的引导下分泌到胞外并切去前导肽，成功实现了格式环肽的高效表达。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种格氏环肽(gassericinA)及其高效表达方法，用于生产和制备格氏环肽，为饲料添加剂、兽药、食品及医药提供一种廉价的生物抗菌剂和防腐剂。本专利技术的目的是通过以下措施实现的：一种分泌型格氏环肽，其特征在于：NprB前导肽位于GaaA蛋白N端，前导肽与GaaA蛋白融合表达，从N端到C端依次为前导肽-GaaA融合蛋白、GaaB蛋白、GaaC蛋白、GaaD蛋白、GaaI蛋白以串联方式排列。优选的，上述分泌型格氏环肽的氨基酸序列为SEQIDNO.2。一种分泌型格氏环肽的表达盒，启动子的3’端连接前导肽编码基因，从5’端到3’端依次为前导肽编码基因nprB、GaaA蛋白编码基因gaaA、GaaB蛋白编码基因gaaB、GaaC蛋白编码基因gaaC、GaaD蛋白编码基因gaaD、GaaI蛋白编码基因gaaI以串联方式排列。上述分泌型格氏环肽的表达盒，前导肽NprB编码基因、GaaA蛋白编码基因、GaaB蛋白编码基因、GaaC蛋白编码基因、GaaD蛋白编码基因、GaaI蛋白编码基因的串联位置有核糖体结合位点。上述分泌型格氏环肽的表达盒，表达盒序列为SEQIDNO.21，用于编码权利要求2所述的分泌型格氏环肽。上述分泌型格氏环肽的表达盒，所述启动子为P43启动子。上述分泌型格氏环肽的制备方法，包括以下步骤：(1)用引物将格氏环肽(gassericinA)合成相关的基因gaaA、gaaBC、gaaDI克隆形成三个片段；(2)并通过In-fusion克隆技术将gaaA、gaaBC、gaaDI基因片段连接于带有NprB信号肽编码基因的表达载体，与载体上的启动子和信号肽基因连接后形成gaaABCDI表达盒；(3)将带有gaaABCDI表达盒的重组载体转化入基因工程菌中筛选阳性重组子；(4)将重组子在培养基中发酵培养，取发酵液测定其抑菌活性和含量；(5)测定发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果检测抑菌活性；(6)发酵液通过过滤后用高效液相法测定其含量。上述分泌型格氏环肽的制备方法，表达载体为带有P43启动子的pP43MNK载体。上述分泌型格氏环肽的制备方法，基因工程菌为枯草芽孢杆菌，发酵液中的格氏环肽表达量为1.5～2g/L。上述分泌型格氏环肽的制备方法，培养基为：豆粕粉1％，酵母粉1％，蛋白胨1％，葡萄糖3％，氯化钠0.5％。有益效果1.本专利技术获得的分泌型格氏环肽，为环状结构，活性好，生物稳定性强，对热、胃液肠液等具有很好的耐受性，抑菌效果显著。2.本专利技术获得的格氏环肽表达盒载体“启动子-前导肽基因-gaaABCDI基因”，通过对格氏环肽不同组分编码基因的重新组合，实现了格氏环肽的环化并运输到胞外分泌表达。3.本专利技术公开了一种分泌型格氏环肽的制备方法，该方法培养成本低，产量高，为格氏环肽的规模产业化生产提供了新的方向和思路。4.本专利技术用In-fusion克隆技术将前导肽片段、gaaA基因片段、gaaBC基因片段、gaaDI基因片段连接于带有启动子的表达载体上，构建格氏环肽表达盒载体“启动子-前导肽基因-gaaABCDI基因”。因载体上有前导肽与gaaABCDI连接，且前导肽与GaaA形成融合蛋白，实现了格氏环肽的环化并运输到胞外分泌表达。将含有格氏环肽表达盒载体，转化入基因工程菌，构建成菌株。菌株在相关培养基中培养，通过测定抑菌圈来判断其活性，HPLC测定格氏环肽在枯草芽孢杆菌中的表达量为2g/L(2mg/mL)。该格氏环肽表达系统表达量高于野生菌，而且发酵培养基成本低、发酵本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分泌型格氏环肽，其特征在于：NprB前导肽位于GaaA蛋白N端

【技术特征摘要】
1.一种分泌型格氏环肽，其特征在于：NprB前导肽位于GaaA蛋白N端，前导肽与GaaA蛋白融合表达，从N端到C端依次为前导肽-GaaA融合蛋白、GaaB蛋白、GaaC蛋白、GaaD蛋白、GaaI蛋白以串联方式排列。


2.如权利要求1所述的一种分泌型格氏环肽，其特征还在于：氨基酸序列为SEQIDNO.2。


3.一种分泌型格氏环肽的表达盒，其特征在于：启动子的3’端连接前导肽编码基因，从5’端到3’端依次为前导肽编码基因nprB、GaaA蛋白编码基因gaaA、GaaB蛋白编码基因gaaB、GaaC蛋白编码基因gaaC、GaaD蛋白编码基因gaaD、GaaI蛋白编码基因gaaI以串联方式排列。


4.如权利要求3所述的一种分泌型格氏环肽的表达盒，其特征在于：前导肽NprB编码基因、GaaA蛋白编码基因、GaaB蛋白编码基因、GaaC蛋白编码基因、GaaD蛋白编码基因、GaaI蛋白编码基因的串联位置有核糖体结合位点。


5.如权利要求3或4所述的一种格氏环肽的表达盒，其特征还在于：表达盒序列为SEQIDNO.21，用于编码权利要求2所述的分泌型格氏环肽。


6.如权利要求3-5所述的一种分泌型格氏...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨飞云，周晓容，肖融，苏国旗，
申请(专利权)人：重庆市畜牧科学院，
类型：发明
国别省市：重庆;50