一种基于氨基酸特异性识别实现蛋白质分离纯化的方法技术

本发明专利技术提供了一种用于实现蛋白质分离纯化的肽链标签，其带有特定氨基酸。本发明专利技术还提供了一种水溶性高分子聚合物，其分子中具有谷氨酰胺单元结构。本发明专利技术还提供了一种基于氨基酸特异性识别实现蛋白质分离纯化方法，其以大肠杆菌为宿主细胞表达带有上述特定氨基酸肽链标签的蛋白；利用谷氨酰胺转氨酶对赖氨酸的伯胺基团和谷氨酰胺的酰胺基团有特异性识别交联的功能，实现带有肽链标签的蛋白与水溶性高分子聚合物的特异性识别交联形成缀合物；利用凝血酶对特定序列的识别与切割，实现对缀合物的切割，完成蛋白质的分离纯化。本发明专利技术利用谷氨酰胺转氨酶和凝血酶对氨基酸特异性识别的方法，将为蛋白质纯化分离等方面提供基础，具有广泛的应用前景。

A method of protein separation and purification based on amino acid specific recognition

【技术实现步骤摘要】
一种基于氨基酸特异性识别实现蛋白质分离纯化的方法
本专利技术属于生物
，一种基于氨基酸特异性识别实现蛋白质纯化分离的方法。
技术介绍
目前蛋白质纯化分离的方法有膜分离、盐溶盐析、等电点沉淀法、凝胶过滤、选择性吸附分离、亲和层析。目前用的较多的方法是镍柱亲和层析。镍柱亲和层析的原理是镍离子可以与带有组氨酸标签的蛋白质结合，而无组氨酸标签的蛋白质不会与镍离子结合，从而会从柱子底端流出。通过梯度洗脱，咪唑竞争性结合到镍离子上，使得目的蛋白被洗脱。在采用镍柱纯化的过程中，可能由于样品或者洗脱的问题，使得纯化后的蛋白溶液中仍然带有部分杂蛋白。因此，目前存在的问题是要研究开发一种在不影响蛋白质活性的情况下对蛋白质进行分离纯化的方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供了一种用于实现蛋白质分离纯化的肽链标签，以及一种水溶性高分子聚合物，所述肽链标签带有特定氨基酸，将该肽链标签的脱氧核糖核苷酸序列插入蛋白基因经表达后所获得的带有该肽链标签的蛋白能够利用谷氨酰胺转氨酶实现蛋白质与所述水溶性高分子聚合物交联，同时使得凝血酶能识别聚合物-蛋白质缀合物，并将蛋白质从缀合物中切割下来。本专利技术还提供了一种上述肽链标签进行蛋白质纯化分离的方法，该方法将上述带有特定氨基酸的肽链标签的基因插入蛋白基因进行表达培养，所获得的带有该肽链标签的蛋白利用谷氨酰胺转氨酶实现蛋白质与上述水溶性高分子聚合物的交联形成聚合物-蛋白质缀合物，再利用凝血酶特异性地将蛋白质从缀合物中切割下来，实现蛋白质的纯化分离，同时能保证蛋白质的活性无明显损失。为此，本专利技术第一方面提供了一种用于分离纯化蛋白质的肽链标签，其肽链长度为11个氨基酸，肽链中带有一个赖氨酸，其氨基酸序列如SequenceNo.1所示。根据本专利技术，在所述肽链中，赖氨酸的位点靠近N端。在本专利技术的一些实施例中，所述肽链的脱氧核糖核苷酸序列如SequenceNo.2所示。本专利技术第二方面提供了一种用于实现蛋白质分离纯化的水溶性高分子聚合物，其分子中带有与谷氨酰胺相似的结构，并且其能够通过本专利技术第一方面所述的肽链标签与蛋白质形成缀合结构。在本专利技术的一些具体实施例中，所述水溶性高分子聚合物的分子中带有谷氨酰胺单元结构。本专利技术第三方面提供了一种如第一方面所述的肽链标签进行蛋白质分离纯化的方法，其包括：步骤K，将肽链标签的脱氧核糖核苷酸序列插入蛋白质基因片段5’端，获得带有肽链标签的脱氧核糖核苷酸序列的蛋白质基因片段；步骤L，表达带有肽链标签的脱氧核糖核苷酸序列的蛋白质基因片段，获得带有肽链标签的蛋白质；步骤M，在谷氨酰胺转氨酶(TGase)存在条件下对带有肽链标签的蛋白质与水溶性高分子聚合物进行交联形成水溶性高分子聚合物-蛋白质缀合物，并通过超滤除去杂蛋白；步骤N，在凝血酶存在条件下对水溶性高分子聚合物-蛋白质缀合物进行切割，获得纯蛋白质；其中，所述水溶性高分子聚合物为本专利技术第二方面所述的水溶性高分子聚合物。根据本专利技术的一些实施方式，在步骤M中，在谷氨酰胺转氨酶(TGase)存在条件下对带有肽链标签的蛋白质与水溶性高分子聚合物进行交联形成水溶性高分子聚合物-蛋白质缀合物，并通过超滤除去杂蛋白，获得除杂后的水溶性高分子聚合物-蛋白质缀合物溶液。在本专利技术的一些实施例中，以底物溶液的体积计谷氨酰胺转氨酶的使用量为1wt％-3wt％。本专利技术中，所述底物溶液由带有肽链标签的粗蛋白质溶液和水溶性高分子聚合物或其水溶液混合后形成。在本专利技术的一些实施例中，以底物溶液体积计含带有肽链标签的蛋白质的含量为5-10mg/mL，水溶性高分子聚合物的含量为3-5mg/mL。在本专利技术的一些实施例中，所述交联的温度为20-30℃。在本专利技术的一些实施例中，交联时间为4-12小时。根据本专利技术的一些进一步的实施方式，在步骤N中，向除杂后的水溶性高分子聚合物-蛋白质缀合物溶液中加入凝血酶，并在凝血酶存在条件下对水溶性高分子聚合物-蛋白质缀合物进行切割，获得纯蛋白质。根据本专利技术，以除杂后的水溶性高分子聚合物-蛋白质缀合物溶液的体积计，凝血酶的使用量为20-30U/mL。在本专利技术的一些实施例中，所述切割的温度为20-37℃。在本专利技术的一些实施例中，切割的时间为3-12小时，优选为3-9小时。根据本专利技术，所述步骤L包括：步骤B，将带有肽链标签的脱氧核糖核苷酸序列的蛋白质的基因片段连接到载体上构建重组表达载体；步骤C，重组表达载体转入宿主细胞，获得表达菌株；步骤D，将表达菌株进行发酵培养，并以诱导剂进行诱导表达，然后将菌体破胞后重新悬浮，离心，收集上清液，获得带有肽链标签的粗蛋白质溶液。本专利技术中，所述宿主细胞为大肠杆菌，优选所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。本专利技术中，所述载体为pET32b(+)载体。本专利技术中，所述诱导剂为IPTG。在本专利技术的一些实施例中，所述诱导剂的加入量为发酵液体积的0.05wt％。根据本专利技术，在步骤D中，将表达菌株接入发酵培养基中进行发酵培养，然后加入诱导剂进行诱导表达培养。根据本专利技术的优选的实施方式，将表达菌株接入发酵培养基中进行发酵培养，当OD600达到0.8-1.0时，加入诱导剂进行诱导表达培养。本专利技术中，所述发酵培养基为LB培养基。在本专利技术的一些实施例中，发酵培养的温度为37℃。在本专利技术的一些实施例中，诱导表达培养的温度为15-25℃。在本专利技术的一些具体优选的实施方式中，在摇床中进行发酵培养。在本专利技术的一些具体优选的实施例中，在本专利技术的所述摇床转速为180rpm。在本专利技术的一些具体优选的实施方式中，在摇床中进行诱导表达培养。在本专利技术的一些具体优选的实施例中，所述摇床转速为180rpm。在本专利技术的一些具体优选的实施例中，所述诱导表达培养的时间为12-20小时。本专利技术是利用基因工程技术，通过大肠杆菌表达带有肽链标签的蛋白质，再利用谷氨酰胺转氨酶(TGase)对肽链中氨基酸的特异性识别来实现蛋白质与高分子聚合物的交联形成缀合物，再利用凝血酶特异性对缀合物切割分离蛋白。该方法具有以下优点：(1)在基因层面实现蛋白质的肽链修饰，不需要对蛋白质再进行体外修饰；(2)采用生物催化剂—谷氨酰胺转氨酶(TGase)交联带有肽链标签的蛋白质，凝血酶从缀合物切割蛋白质，该方法具有特异性识别的功能；(3)谷氨酰胺转氨酶(TGase)和凝血酶不会成为产物的一部分，可以实现重复利用；(4)将蛋白分子在基因层面改造，使得其自带肽链，将肽链交联，不会影响蛋白质分子本身的结构和性能。附图说明下面结合附图来对本专利技术作进一步详细说明：图1示出谷氨酰胺的结构式。图2为由N-苄氧羰基-L-谷氨酰胺(Z-QG)制备合成水溶性高分子聚合物的单体(Z-QG-E本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于实现蛋白质分离纯化的肽链标签，其肽链长度为11个氨基酸，肽链中带有一个赖氨酸，其氨基酸序列如Sequence No.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于实现蛋白质分离纯化的肽链标签，其肽链长度为11个氨基酸，肽链中带有一个赖氨酸，其氨基酸序列如SequenceNo.1所示。


2.根据权利要求1所述的肽链标签，其特征在于，在所述肽链中，赖氨酸的位点靠近N端；和/或，所述肽链的脱氧核糖核苷酸序列如SequenceNo.2所示。


3.一种用于实现蛋白质分离纯化的水溶性高分子聚合物，其分子中带有与谷氨酰胺相似的结构，并且其能够通过权利要求1或2所述的肽链标签与蛋白质形成缀合结构。


4.根据权利要求3所述的水溶性高分子聚合物，其特征在于，所述水溶性高分子聚合物的分子中带有谷氨酰胺单元结构。


5.一种利用权利要求1或2所述的肽链标签进行蛋白质分离纯化的方法，其包括：
步骤K，将肽链标签的脱氧核糖核苷酸序列插入蛋白质基因片段5’端，获得带有肽链标签的脱氧核糖核苷酸序列的蛋白质基因片段；
步骤L，表达带有肽链标签的脱氧核糖核苷酸序列的蛋白质基因片段，获得带有肽链标签的蛋白质；
步骤M，在谷氨酰胺转氨酶(TGase)存在条件下对带有肽链标签的蛋白质与水溶性高分子聚合物进行交联形成水溶性高分子聚合物-蛋白质缀合物，并通过超滤除去杂蛋白；
步骤N，在凝血酶存在条件下对水溶性高分子聚合物-蛋白质缀合物进行切割，获得纯蛋白质；
其中，所述水溶性高分子聚合物为权利要求3或4所述的水溶性高分子聚合物。


6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，在步骤M中，将谷氨酰胺转氨酶加入到带有肽链标签的蛋白质和水溶性高分子聚合物的底物溶液中进行交联形成水溶性高分子聚合物-蛋白质缀合物，并通过超滤除去杂蛋白，获得除杂后的水溶性高分子聚合物-蛋白质缀合物溶液；优选地，以底物溶液的体积计谷氨酰胺转氨酶的使用量为1wt％-3wt％；和/或，所述底物溶液由带有肽链标签的粗蛋白质溶液和水溶性高分子聚合物或其水溶液混合后形成；优选地，以底物溶液体积计含带有肽链标签的蛋白质的含量为5-1...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈必强，邵文铉，张晓楠，谭天伟，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：北京;11