一种解淀粉芽孢杆菌产抑菌活性物质的方法技术

一种解淀粉芽孢杆菌产抑菌活性物质的方法，属于微生物技术领域。本发明专利技术对解淀粉芽孢杆菌进行培养，得到发酵上清液，对上清液分离纯化后制得一种新的六肽。本发明专利技术提供的方法所得发酵上清液可以直接用于抑菌，经过对发酵上清液进一步分离纯化后可以得到三种抑菌物质，其中包括一种新的六肽，同样具有抑菌作用；当三者联合作用于指示菌细胞时，对细胞损伤程度更大。三者之间两两组合作用指示菌发现乳酸与Surfactin具有协同作用；乳酸与六肽具有协同作用；Surfactin与六肽具有相加作用。为新型抗菌肽的不断开发提供理论支撑，为天然抑菌物质的高效使用提供新思路。

A method for the production of antibacterial substances by Bacillus amylolyticus

【技术实现步骤摘要】
一种解淀粉芽孢杆菌产抑菌活性物质的方法
本专利技术涉及一种解淀粉芽孢杆菌产抑菌活性物质的方法，属于微生物

技术介绍
解淀粉芽孢杆菌，属于革兰氏阳性菌，兼性厌氧型，能够产生乳酸，可产生抑菌活性物质，抑制某些腐败和病原微生物生长。由于其对人体无毒无害，在动物肠道中对肠道致病菌有较佳的抑制力，可以应用于医疗保健领域。有关研究表明，解淀粉芽孢杆菌可产生抑菌活性物质，但由于该类产物依赖于发酵条件的控制，且发酵产物中抑菌物质的成分复杂，其含量较低，对抑菌物质的作用机理研究不够深入，限制了其发展应用。因此明确抑菌主要成分及多种成分之间的协同抑菌作用机理是目前解决抑菌物质高效利用的关键。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种解淀粉芽孢杆菌产抑菌活性物质的方法，其发酵上清液可以直接用于抑菌，经过分离纯化后还可得到一种新的六肽，具有抑菌作用。本专利技术的第一个目的在于提供一种六肽，其由解淀粉芽孢杆菌发酵上清液分离产生，具有抑菌活性。上述六肽的氨基酸序列具体为Leu-Val-Asn-Pro-Pro-Thr。本专利技术的第二个目的在于对解淀粉芽孢杆菌进行培养，得到发酵上清液。在本专利技术的一种实施方式中，所述解淀粉芽孢杆菌培养条件为培养温度48-52℃，初始pH6-8，种龄2.5-5.5h，接种量1.5%-2％，装液量45-50mL。在本专利技术的一种实施方式中，所述培养基具体为：麦芽糖9-11g/L，蛋白胨14-16g/L，MgSO4·7H2O1.5-2g/L，活性CaCO38-10g/L。本专利技术的第三个目的在于提供解淀粉芽孢杆菌产抑菌活性物质的方法，对所得发酵上清液以金黄色葡萄球菌为指示菌，通过酸沉、有机溶剂萃取，DEAE阴离子交换层析，结合制备型RP-HPLC层析分离纯化，得到抑菌活性物质，对纯化产物进行LC-MS分析。在本专利技术的一种实施方式中，所述金黄色葡萄球菌具体为StaphylococcusaureusATCC29213。在本专利技术的一种实施方式中，具体步骤如下：（1）对所得发酵上清液中缓慢滴加6mol×L-1HCl，不断搅拌至pH为2，4℃过夜保存；在4℃下，以8000r×min-1离心20min，弃上清，用等量的无菌水重悬沉淀，用2mol×L-1NaOH调节pH至7；冷冻干燥后，用体积比3:1的三氯甲烷与甲醇多次萃取，40℃旋转蒸发仪蒸发有机溶剂，得到黄色晶体；测定蛋白浓度并检测抑菌活性；（2）进行DEAE阴离子交换层析，色谱柱：DEAE-Sepharose-FastFlow阴离子色谱柱，流动相A:20mmol/L，pH8的Tris-HCl缓冲液，流动相B：1mol/LNH4HCO3的Tris-HCl缓冲液，进样量：5mL，检测波长：220nm；用3倍柱体积的缓冲液A洗脱后，依次用0％、60％、80％和100％浓度的流动相B进行梯度洗脱；以金黄色葡萄球菌作为指示菌，采用改良牛津杯法测定分离峰的抑菌活性；（3）对分离峰B进行RP-HPLC分离；色谱条件：WatersXBridgePrepC18色谱柱，10×250mm，5μm，流动相A：含0.1％TFA的乙腈，流动相B：含0.1％TFA的超纯水，流速：0.5mL/min，检测波长：220nm，进样量：0.5mL；用流动相B平衡3倍柱体积，选择线性洗脱方式；（4）收集抑菌活性较高的分离峰，选用WATERSACQUITYUPLC色谱仪，层析柱：BEHC18；2.1×50mm1.7μm，流动相A：含0.1％TFA的乙腈，流动相B：含0.1％TFA的Milli-Q水，流速0.3mL/min，进样量：5μL，检测波长220nm，柱温：45℃，梯度洗脱：0~3min，5％A相95％B相；3~15min，5％~95％A相，95％~5％B相；15~17min，95％~100％A相，5％~0％B相；17.1min，5％A相，95％B相；UPLC分离峰被注入WATERSMALDISYNAPTQ-TOFMS，采用正离子模式电喷雾，获得信号峰的质谱图。本专利技术的第四个目的在于提供一种抑菌活性物质对致病菌的细胞膜作用的研究方法，是将分离纯化得到的抑菌物质作用于金黄色葡萄球菌的细胞膜。在本专利技术的一种实施方式中，所采用的方法有测定作用致病菌前后，其胞外K+、OD260、OD280浓度变化，及通过电子显微镜观察细胞形态变化。利用改良牛津杯方法与抑菌率计算方法结合对抑菌活性考察。抑菌率是指取100μLBCA浓度为1mg/mL的抑菌剂与100μL菌浓度为108CFU/mL的指示菌菌悬液混合均匀，37℃，培养24h，用酶标仪测OD600，记为A1。等量无菌LB液体培养基代替抑菌剂作对照，记为A0。式中：A1为实验组的吸光度；A0为对照组的吸光度。通过对解淀粉芽孢杆菌上清液中抑菌物质的分离，纯化得到三种抑菌活性物质，分别为乳酸、含有C13-15的表面活性肽和六肽；经过液相质谱分析（LC-MS）其中一种为含有C13-15的Surfactin物质，另一种为6个氨基酸（Leu-Val-Asn-Pro-Pro-Thr）组成的新型抑菌肽。再一种为乳酸。以金黄色葡萄球菌为指示菌，测定六肽、Surfactin与乳酸的最小抑制浓度分别为0.8mg/mL、0.5mg/mL、1.563mg/mL。本专利技术的第五个目的是提供解淀粉芽孢杆菌所产的三种抑菌活性物质之间的协同抑菌作用效果。在本专利技术的一种实施方式中，采用三种抑菌物质两两组合作用于指示菌。在本专利技术的一种实施方式中，分离纯化后得到三种抑菌活性物质，分别为乳酸、含有C13-15的表面活性肽和六肽；对三种抑菌物质的机理研究发现乳酸可破坏细胞壁，六肽可透过细胞壁作用细胞膜，进一步对细胞损伤，Surfactin不仅可破坏细胞壁，还能透过细胞膜作用细胞内部，干扰细胞分裂。当三者联合作用于指示菌细胞时，对细胞损伤程度更大。三者之间两两组合作用指示菌，发现乳酸与Surfactin具有协同作用；乳酸与六肽具有协同作用；Surfactin与六肽具有相加作用。为新型抗菌肽的不断开发提供理论支撑，为天然抑菌物质的高效使用提供新思路。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的方法所得发酵上清液可以直接用于抑菌，经过对发酵上清液进一步分离纯化后可以得到三种抑菌物质，其中包括一种新的六肽，同样具有抑菌作用；当三者联合作用于指示菌细胞时，对细胞损伤程度更大。三者之间两两组合作用指示菌发现乳酸与Surfactin具有协同作用；乳酸与六肽具有协同作用；Surfactin与六肽具有相加作用。为新型抗菌肽的不断开发提供理论支撑，为天然抑菌物质的高效使用提供新思路。附图说明图1为DEAE阴离子交换层析图谱。图2为分离峰B的RP-HPLC层析图谱。图3为分离纯化活性峰的抑菌直径。图4为活性峰D的色谱图。图5为主要信号峰的二级质谱图。图6为活性峰F的色谱图。图7为活性峰F的质谱图。图8为乳酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种六肽，其特征在于：由解淀粉芽孢杆菌发酵上清液分离产生，具有抑菌活性。/n

【技术特征摘要】
1.一种六肽，其特征在于：由解淀粉芽孢杆菌发酵上清液分离产生，具有抑菌活性。


2.根据权利要求1所述六肽，其特征在于：其氨基酸序列具体为Leu-Val-Asn-Pro-Pro-Thr。


3.一种解淀粉芽孢杆菌产抑菌活性物质的方法，其特征在于：对解淀粉芽孢杆菌进行培养，得到发酵上清液。


4.根据权利要求3所述解淀粉芽孢杆菌产抑菌活性物质的方法，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌培养条件为培养温度48-52℃，初始pH6-8，种龄2.5-5.5h，接种量1.5%-2％，装液量45-50mL；
所述培养基具体为：麦芽糖9-11g/L，蛋白胨14-16g/L，MgSO4·7H2O1.5-2g/L，活性CaCO38-10g/L。


5.根据权利要求3所述解淀粉芽孢杆菌产抑菌活性物质的方法，其特征在于：对所得发酵上清液以金黄色葡萄球菌为指示菌，通过酸沉、有机溶剂萃取，DEAE阴离子交换层析，结合制备型RP-HPLC层析分离纯化，得到抑菌活性物质，对纯化产物进行LC-MS分析。


6.根据权利要求5所述解淀粉芽孢杆菌产抑菌活性物质的方法，其特征在于：所述金黄色葡萄球菌具体为StaphylococcusaureusATCC29213。


7.根据权利要求5所述解淀粉芽孢杆菌产抑菌活性物质的方法，其特征在于具体步骤如下：
（1）对所得发酵上清液中缓慢滴加6mol×L-1HCl，不断搅拌至pH为2，4℃过夜保存；在4℃下，以8000r×min-1离心20min，弃上清，用等量的无菌水重悬沉淀，用2mol×L-1NaOH调节pH至7；冷冻干燥后，用体积比3:1的三氯甲烷与甲醇多次萃取，40℃旋转蒸发仪蒸发有机溶剂，得到黄色晶体；测定蛋白浓度并检测抑菌活性；
（2）进行DEAE阴离子交换层析，色谱柱：DEAE-Sepharose-FastFlow阴离子色谱柱，流动相A：20mmol/L，...

【专利技术属性】
技术研发人员：周楠迪，田亚平，姚佳明，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32