一种阿胶多肽及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种阿胶多肽及其制备方法，属于分析化学技术领域。所述阿胶多肽的氨基酸序列为YQCLKGTGK、CTTPPPSSGPKYQCLK、MDNPDTFYSLKYQIK、FAAFIDK、ANKGFLEEVR中的一种。所属阿胶多肽的制备方法为阿胶研磨成粉炖化制得阿胶提取液，然后经胰蛋白酶酶解、固相萃取柱分离纯化，液相色谱‑质谱联用检测分析合成获得。本发明专利技术的阿胶多肽有羟基自由基清除活性和抗凝血活性，并且阿胶多肽呈浓度‑功效相关性。

A kind of donkey hide gelatin polypeptide and its preparation method

【技术实现步骤摘要】
一种阿胶多肽及其制备方法
本专利技术属于分析化学
，具体涉及一种阿胶多肽及其制备方法。技术背景：阿胶是我国传统名贵中药，与人参、鹿茸并称“中药三宝”，迄今已有3000年的药用历史，同时也被我国列为具有免疫调节及改善营养性贫血功能的药食同源产品，长期以来深受人们喜爱。阿胶以马科动物驴的皮去毛熬制成而成，我国诸版药典均以驴皮制胶为“阿胶”。根据《中华人民共和国药典》（2015版），阿胶的功能有补血滋阴、润燥、止血。近年来，研究人员应用了多种技术手段以期揭示阿胶的功效作用。然而，对阿胶化学成分的研究并未发现阿胶中含有明确具有药理作用的物质，现有的文献针对的都是阿胶本身进行的功效研究，也因此对于阿胶功效出现争议。阿胶的基本成分是驴皮所含原胶原的降解物，蛋白类含量约60%~80%左，蛋白经酶解后生成的肽涉及生物体内多种细胞功能的生物活性，是机体完成各种复杂的生理活性必不可少的参与者，涉及激素、神经、细胞生长和生殖各领域，细胞的功能活动受肽的调节。阿胶作为药品或食品服用后，进入人体经消化过程同样是酶解成肽后被再人体吸收，因此，以肽为目标物对阿胶功效进行评价是科学可行的。基于此考虑，本专利技术提出了一种通过分离遴选阿胶中的肽段，以考察肽段的活性来验证阿胶功效的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种阿胶多肽及其制备方法。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种阿胶多肽，其氨基酸序列为：YQCLKGTGK、CTTPPPSSGPKYQCLK、MDNPDTFYSLKYQIK、FAAFIDK、ANKGFLEEVR中的一种。上述一种阿胶多肽的制备方法，包括以下步骤：（1）阿胶提取液的制备：阿胶研磨成粉，加去离子，在一定温度下炖化，冷却后冷藏过夜，离心取炖化液上清，制得阿胶提取液；（2）阿胶多肽的制备：步骤（1）的阿胶提取液经胰蛋白酶酶解，取酶解液上清，经C18固相萃取柱分离纯化，洗脱液干燥后再溶解过0.45µm滤膜，得阿胶多肽；（3）步骤（2）制备所得阿胶多肽以液相色谱-质谱联用进行检测；（4）步骤（3）的检测结果进行数据分析,合成阿胶多肽氨基酸序列。上述步骤（1）阿胶提取液的制备，具体为：阿胶研细成阿胶粉，加入20倍重量的去离子水，80℃炖化30min，冷却后冷藏过夜，将炖化液于4℃以18000rpm离心5min，取上清液过滤后，得阿胶提取液。上述步骤（2）阿胶多肽的制备，具体为：步骤（1）制备的阿胶提取液以10%NaOH溶液调节pH=7.5，40℃水浴中以浓度为3×104U/g~6×104U/g胰蛋白酶酶解，酶解过程中每隔1h调节一次pH，使pH值始终保持在7.5；酶解4h后灭酶活，冷却后于4℃以18000rpm离心5min，取上清液3mL过C18固相萃取柱分离纯化（预先以3mL甲醇、3mL去离子水活化），以3×3mL甲醇洗脱，收集洗脱液，45℃氮吹干，以1mL1%甲酸溶液溶解，过0.45µm滤膜，得阿胶多肽。上述步骤（3）中所述阿胶多肽以液相色谱-质谱联用进行检测，其中液相色谱条件为：HypersilGOLDUPLCC18色谱柱，100m×2.1mm，1.9µm；柱温：30℃；流动相：A：0.1%甲酸水，B：乙腈，洗脱梯度：0~50min，乙腈10%~90%；50~55min，乙腈90%；55~56min，乙腈90%~10%；56~60min，乙腈10%；流速：0.3mL/min；进样量：10µL。上述步骤（3）中阿胶多肽以液相色谱-质谱联用进行检测，其中质谱条件为：扫描模式：FullMS/dd-MS2，分析时长60min，检测方式：正离子，母离子扫描范围：100-1500m/z，一级质谱分辨率：70000atm/z，AGGtarget:le6，一级MaximumIT:100ms，Numberofscanranges:1，动态排除(Dynamicexclusion):40.0s一次，MS2ActivationType:HCD，Isolationwindow:0.4m/z，二级质谱分辨率：17500atm/z200，Microscans:1，二级MaximumIT:50ms，碰撞能量:30eV，Underfillratio:0.1%；电喷雾离子源(ESI)：载气为高纯氮气(纯度>99.5%)，鞘气流速40个单位(arb)，辅气流速15个单位(arb)；喷雾电压3.2KV；碰撞池采用梯度碰撞能量：25%、35%、55%；毛细管温度320℃，离子透镜电压频率(S-lensRFlevel)为60，辅气热源温度350℃。上述步骤（4）对步骤（3）的检测结果进行数据分析，具体为：采用MaxQuant(版1.6.1.0)进行数据分析；搜索针对包含来自Uniprot的阿胶(uniprot-donkey-hidegelatin.fasta)的蛋白质序列（https://www.uniprot.org，2018年11月3日下载）数据库；蛋白FDR设置为0.01；最小氨基酸长度设置为3；可变修饰设为N-Acetyl和Oxidation(M)；固定化修饰设置为Carbamidomethyl(C)；专一性酶设置为胰蛋白酶；最大裂解丢失设置为2，所有常见的污染物和相反的命中被删除。一种阿胶多肽的功效评价：检测上方法制备所得阿胶多肽的羟基自由基清除活性和抗凝血活性。羟基自由基清除活性检测方法：在酶标板中依次加入40uL浓度为1.865mmol/L邻菲啰啉溶液、80uL步骤2过0.45µm滤膜所得阿胶多肽样液、40uL浓度为1.865mmol/L的FeS04·7H20溶液和40uL浓度为0.03%(v/v)的H202溶液；将酶标板于37℃恒温60min，536nm处测定吸光值，以同浓度抗坏血酸标准溶液作对照。抗凝血活性检测方法：酶标仪温度为37℃，测定波长405nm；以Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，pH7.2~7.4）配制浓度为0.1%纤维蛋白原溶液和12U/mL凝血酶溶液；在酶标板中加入140μL纤维蛋白原溶液和40μL样品溶液，混匀后读数（ASB）；再加入10μL凝血酶溶液开始反应，37℃恒温培养箱反应10min后，酶标仪测读数（AS）；取40μLTris-HCl缓冲液代替样品溶液，分别在凝血酶加入前、后测得吸光值（凝血酶加入前酶标仪读数以ACB表示，凝血酶加入后读数以AC表示）。以市售华法林钠片（有效成分为3-（3-氧代-1-苯基丁基）-4-羟基-2H-1-苯并吡喃二酮钠盐，分子式为C19H15NaO4）作对照，按有效成分换算并配制成同浓度溶液。按下式计算样品抑制凝血酶催化纤维蛋白原形成纤维蛋白的能力：本专利技术的优点在于：本专利技术公开了一种阿胶多肽及其制备方法。其中种阿胶多肽的氨基酸序列明确，为YQCLKGTGK、CTTPPPSSGPKYQCLK、MDNPDTFYSLKYQIK、FAAFIDK、ANKGFLEEVR中的一种。本专利技术的阿胶多肽具有羟基自由基清除活性和抗凝血活性，并且阿胶多肽具有浓度本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种阿胶多肽，其特征在于，其氨基酸序列为：YQCLKGTGK、CTTPPPSSGPKYQCLK、MDNPDTFYSLKYQIK、FAAFIDK、ANKGFLEEVR中的一种。/n

【技术特征摘要】
1.一种阿胶多肽，其特征在于，其氨基酸序列为：YQCLKGTGK、CTTPPPSSGPKYQCLK、MDNPDTFYSLKYQIK、FAAFIDK、ANKGFLEEVR中的一种。


2.如权利要求1所述一种阿胶多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）阿胶提取液的制备：阿胶研磨成粉，加去离子，在一定温度下炖化，冷却后冷藏过夜，离心取炖化液上清，制得阿胶提取液；
（2）阿胶多肽的制备：步骤（1）的阿胶提取液经胰蛋白酶酶解，取酶解液上清，经C18固相萃取柱分离纯化，洗脱液干燥后再溶解过0.45µm滤膜，得阿胶多肽；
（3）步骤（2）制备所得阿胶多肽以液相色谱-质谱联用进行检测；
（4）步骤（3）的检测结果进行数据分析,合成阿胶多肽氨基酸序列。


3.根据权利要求2所述一种阿胶多肽的制备方法，其特征在于：步骤（1）阿胶提取液的制备，具体为：阿胶研细成阿胶粉，加入20倍重量的去离子水，80℃炖化30min，冷却后冷藏过夜，将炖化液于4℃以18000rpm离心5min，取上清液过滤后，得阿胶提取液。


4.根据权利要求2所述一种阿胶多肽的制备方法，其特征在于：步骤（2）阿胶多肽的制备，具体为：步骤（1）制备的阿胶提取液以10%NaOH溶液调节pH=7.5，40℃水浴中以浓度为3×104U/g~6×104U/g胰蛋白酶酶解，酶解过程中每隔1h调节一次pH，使pH值始终保持在7.5；酶解4h后灭酶活，冷却后于4℃以18000rpm离心5min，取上清液3mL过C18固相萃取柱分离纯化，预先以3mL甲醇、3mL去离子水活化，以3×3mL甲醇洗脱，收集洗脱液，45℃氮吹干，以1mL1%甲酸溶液溶解，过0.45µm滤膜，得阿胶多肽。


5.根据权利要求2所述一种阿胶多肽的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中阿胶多肽液相色谱-质谱联用进行检测，其液相色谱分离纯化的条件为：HypersilGOL...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨方，熊雅茹，
申请(专利权)人：福州海关技术中心，
类型：发明
国别省市：福建;35