一种用于猪肺炎支原体低血清培养的培养基制造技术

本发明专利技术公开了一种用于猪肺炎支原体低血清培养的培养基，属于动物疫苗生产技术领域。本发明专利技术的培养基由以下组分构成：MEM培养基、酵母粉、蛋白胨、葡萄糖、马血清蛋白冻干粉、转铁蛋白、丙酮酸钠、氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、苯酚红。本发明专利技术的培养基成分简单、低廉、易获取，其通过添加MEM、酵母粉、蛋白胨、葡萄糖、马血清蛋白冻干粉、丙酮酸钠、氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和苯酚红等组分，可大大降低在猪肺炎支原体培养时的猪血清添加量，从而可以降低猪肺炎支原体的培养成本，并且还能保持猪肺炎支原体良好的生长状态以及较快的生长速度。

A medium for low serum culture of Mycoplasma hyopneumoniae

【技术实现步骤摘要】
一种用于猪肺炎支原体低血清培养的培养基
本专利技术涉及动物疫苗生产
，特别涉及一种用于猪肺炎支原体低血清培养的培养基。
技术介绍
猪支原体肺炎，又称猪地方性流行肺炎，是由猪肺炎支原体引起的以慢性、高度传染性、高发病率和低死亡率为主要特点的呼吸道疾病。感染猪长期发育不良、饲料转化率低、日增重下降，严重影响养猪业的经济效益。猪肺炎支原体和其他呼吸道疾病的病原，如猪繁殖与呼吸道综合征病毒、放线杆菌、多杀性巴氏杆菌、猪流感病毒、圆环病毒2型混合感染时，会使病情加剧，引起猪的死亡。猪支原体肺炎是一种顽固性慢性病，抗支原体药物治疗一般可以抑制该病但很难清除，用药后咳喘症状消失，但停药后容易再次复发。加上近几年支原体耐药株的出现，使得药物防治更加困难，目前疫苗接种仍是预防猪支原体最为经济有效的手段。猪肺炎支原体属于原核生物，是最小的细胞，无细胞壁、生长速度慢、对培养条件要求较为苛刻。在猪肺炎支原体疫苗的生产和研究过程中，往往需要通过往培养基中添加猪血清，以便于对分离的猪肺炎支原体进行高效的培养。然而，使用传统商用培养基对猪肺炎支原体进行培养时，一般需要添加20％左右的猪血清，血清用量高，增加了培养成本及猪的过敏风险；一些商品化培养基要分两部分配制，一部分高压处理，一部分过滤处理，配制过程繁琐；传统方法采用煮沸猪肺组织制备培养基，支原体生长速度慢，菌体活力差；同时由于支原体培养的特殊性，导致培养基成为支原体疫苗研发的难点和关键点。
技术实现思路
为了弥补现有技术的不足，本专利技术提供了一种用于猪肺炎支原体低血清培养的培养基。本专利技术的技术方案为：一种用于猪肺炎支原体低血清培养的培养基，由以下组分构成：MEM培养基4-8g/L、酵母粉3-7g/L、蛋白胨15-20g/L、葡萄糖5-12g/L、马血清蛋白冻干粉6-10g/L、转铁蛋白30-100μg/L、丙酮酸钠0.6-2.0g/L、氯化钠3-7g/L、磷酸二氢钾0.1-0.4g/L、磷酸氢二钾0.5-2.5g/L、苯酚红0.005-0.02g/L。本专利技术的培养基中含有猪肺炎支原体生长的必需营养成分。猪肺炎支原体作为最小的细胞，其基因组小且数量有限，从而导致生物合成途径缺乏，需要从外界摄取氨基酸、糖类、微量元素等物质。MEM培养基含有细胞培养所需的20多种必须氨基酸；葡萄糖作为单糖类速效碳源，可被支原体快速利用，为菌体生长提供能量，但含量过高，导致其他生物途径激活，增加乙酸等代谢产物，导致代谢毒性。蛋白胨、马血清蛋白冻干粉、酵母粉营养丰富，可为猪肺炎支原体的生长提供氮源，马血清蛋白冻干粉和酵母粉中含有前提类物质及微量元素，可有效促进支原体的生长。转铁蛋白作为载体可结合铁离子，具有生物活性，同时可促进细胞的有丝分裂；丙酮酸钠作为一种能量物质，参与支原体细胞的代谢过程。几种无机盐离子具有维持培养基渗透压平衡的作用，Na+/K+可调节膜电位，SO42-是机制所需的阴离子，同时也是形成大分子的养分前体以及细胞内电荷的调节者，调节菌体的生长代谢。猪肺炎支原体(Mhp)具有完整的糖酵解途径，能代谢葡萄糖产酸，因此，可利用酚红作为指示剂，通过颜色变化来反映其生长情况。作为优选方案，由以下组分构成：MEM培养基5-7g/L、酵母粉4-6g/L、蛋白胨16-18g/L、葡萄糖6-8g/L、马血清蛋白冻干粉7-9g/L、转铁蛋白50-80μg/L、丙酮酸钠1.0-1.5g/L、氯化钠4-6g/L、磷酸二氢钾0.2-0.3g/L、磷酸氢二钾1.3-1.7g/L、苯酚红0.008-0.012g/L。进一步地，由以下组分构成：MEM培养基6g/L、酵母粉6g/L、蛋白胨16.5g/L、葡萄糖6.5g/L、马血清蛋白冻干粉8g/L、转铁蛋白60μg/L、丙酮酸钠1.5g/L、氯化钠5.2g/L、磷酸二氢钾0.24g/L、磷酸氢二钾1.56g/L、苯酚红0.01g/L。所述用于猪肺炎支原体低血清培养的培养基的制备方法，4-8gMEM培养基、3-7g酵母粉、15-20g蛋白胨、5-10g葡萄糖、6-10g马血清蛋白冻干粉、30-100μg转铁蛋白、0.6-2.0g丙酮酸钠、3-7g氯化钠、0.1-0.4g磷酸二氢钾、0.5-2.5g磷酸氢二钾、0.005-0.02g苯酚红置于容器中，加注射用水摇匀，继续加注射用水定容至1L，除菌过滤即可。所述培养基用于猪肺炎支原体低血清培养的方法，包括步骤：1)在无菌条件下，向所述培养基中家加入占培养基质量分数0.5％～5％的猪血清，得到培养液；2)向步骤1)所得培养液中加入猪肺炎支原体菌液，并置于恒温条件下摇瓶培养。作为优选方案，步骤1)中，向所述培养基中家加入占培养基质量分数0.5％～5％的猪血清。作为优选方案，步骤2)中，摇瓶培养的温度为33～40℃。作为优选方案，步骤2)中，猪肺炎支原体菌液与培养液的体积之比为1:8～12。本专利技术的有益效果为：1)本专利技术的培养基成分简单、价格低廉、易获取，其通过添加MEM、酵母粉、蛋白胨、葡萄糖、马血清蛋白冻干粉、转铁蛋白、丙酮酸钠、氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和苯酚红等组分，可大大降低在猪肺炎支原体培养时的猪血清添加量，从而可以降低猪肺炎支原体的培养成本，并且还能保持猪肺炎支原体良好的生长状态以及较快的生长速度。2)本专利技术的培养基制备方法简单，使用前加注射水无菌过滤即可。3)本专利技术的培养基用于猪肺炎支原体的培养，操作简单、成本低，可满足疫苗生产的规定，同时可实现疫苗行业大规模生产的需要。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1：本实施例提供了一种用于猪肺炎支原体低血清培养的培养基，该培养基由以下组分构成：MEM培养基6.0g/L、酵母粉6.0g/L、蛋白胨16.5g/L、葡萄糖6.5g/L、马血清蛋白冻干粉8.0g/L、转铁蛋白60μg/L、丙酮酸钠1.5g/L、氯化钠5.2g/L、磷酸二氢钾0.24g/L、磷酸氢二钾1.56g/L、苯酚红0.01g/L。该培养基的制备方法包括以下步骤：将6.0g的MEM、6.0g的酵母粉、16.5g的蛋白胨、6.5g的葡萄糖、8.0g的马血清蛋白冻干粉、60μg转铁蛋白、1.5g的丙酮酸钠、5.2g的氯化钠、0.24g的磷酸二氢钾、1.56g的磷酸氢二钾以及0.01g的苯酚红添加到1L的容量瓶中，加适量注射用水，摇匀，再往容量瓶中添加注射用水，定容至1L，除菌过滤即可得到培养基。实施例2：本实施例提供了一种用于猪肺炎支原体低血清培养的培养基，该培养基由以下组分构成：MEM培养基4.0g/L、酵母粉3.0g/L、蛋白胨本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于猪肺炎支原体低血清培养的培养基，其特征在于，由以下组分构成：MEM培养基4-8 g/L、酵母粉3-7 g/L、蛋白胨15-20 g/L、葡萄糖5-12 g/L、马血清蛋白冻干粉6-10g/L、转铁蛋白30-100 μg/L、丙酮酸钠0.6-2.0 g/L、氯化钠3-7 g/L、磷酸二氢钾0.1-0.4g/L、磷酸氢二钾0.5-2.5 g/L、苯酚红0.005-0.02 g/L。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于猪肺炎支原体低血清培养的培养基，其特征在于，由以下组分构成：MEM培养基4-8g/L、酵母粉3-7g/L、蛋白胨15-20g/L、葡萄糖5-12g/L、马血清蛋白冻干粉6-10g/L、转铁蛋白30-100μg/L、丙酮酸钠0.6-2.0g/L、氯化钠3-7g/L、磷酸二氢钾0.1-0.4g/L、磷酸氢二钾0.5-2.5g/L、苯酚红0.005-0.02g/L。


2.如权利要求1所述用于猪肺炎支原体低血清培养的培养基，其特征在于，由以下组分构成：MEM培养基5-7g/L、酵母粉4-6g/L、蛋白胨16-18g/L、葡萄糖6-8g/L、马血清蛋白冻干粉7-9g/L、转铁蛋白50-80μg/L、丙酮酸钠1.0-1.5g/L、氯化钠4-6g/L、磷酸二氢钾0.2-0.3g/L、磷酸氢二钾1.3-1.7g/L、苯酚红0.008-0.012g/L。


3.如权利要求2所述用于猪肺炎支原体低血清培养的培养基，其特征在于，由以下组分构成：MEM培养基6g/L、酵母粉6g/L、蛋白胨16.5g/L、葡萄糖6.5g/L、马血清蛋白冻干粉8g/L、转铁蛋白60μg/L、丙酮酸钠1.5g/L、氯化钠5.2g/L、磷酸二氢钾0.24g/L、磷酸氢二钾1.56g/L、苯酚红0.01g/L。
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【专利技术属性】
技术研发人员：耿兴良，朱杰，徐海军，桑锋锋，陈俊杰，杨合涛，杨灵芝，
申请(专利权)人：山东滨州沃华生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37