【技术实现步骤摘要】
一种用于创口皮肤修复的富含hEGF的冻干粉的制备方法
本专利技术涉及生物
，具体是一种用于创口皮肤修复的富含hEGF的冻干粉的制备方法。
技术介绍
皮肤创口愈合是指皮肤组织遭受外力作用后出现离断或缺损后的愈复过程，包括了皮肤组织再生，肉芽组织增生及瘢痕形成的复杂组合，表现出各种修复过程的协同作用。皮肤创伤包括皮肤擦伤、皮肤烧烫伤和慢性溃疡创面等。烧伤主要是对皮肤和黏膜以及深层皮肤组织，通过热力、化学物质、电能、放射线等方式引起的严重损害，其中比较常见的就是皮肤热力烧伤。相关统计结果显示，每年因为意外伤害致死排在首位的是交通事故，其次就是烧伤，而且在交通事故中，也有很多伤员是因为合并烧伤更损害，我国每年有1.5％-25％的人是由于烧伤致病的，也就是说每年发生不同程度烧伤的人数在2000万人，其中有5％的烧伤患者需要入院接受治疗。目前治疗普通烧汤伤的常用临床药物是以消炎药和中药药膏为主，但对于大面积烧烫伤需要进行皮肤移植，可是无论是自体或异体皮肤移植，均会受到供体来源和免疫排斥反应的限制。因此，寻找无排斥反应、促进皮肤损伤...
【技术保护点】
1.一种用于创口皮肤修复的富含hEGF的冻干粉的制备方法，其特征在于：所述冻干粉通过含有过表达hEGF基因的生产用干细胞的培养上清液冻干制备而成。/n
【技术特征摘要】
1.一种用于创口皮肤修复的富含hEGF的冻干粉的制备方法，其特征在于：所述冻干粉通过含有过表达hEGF基因的生产用干细胞的培养上清液冻干制备而成。
2.根据权利要求1所述的一种用于创口皮肤修复的富含hEGF的冻干粉的制备方法，其特征在于：所述培养上清液的细胞浓度≥1×107个/ml。
3.根据权利要求1所述的一种用于创口皮肤修复的富含hEGF的冻干粉的制备方法，其特征在于：所述冻干粉中包含过表达的hEGF、人角质细胞生长因子、人成纤维细胞生长因子、人血小板样衍生生长因子和纤维连接蛋白。
4.根据权利要求1所述的一种用于创口皮肤修复的富含hEGF的冻干粉的制备方法，其特征在于：所述冻干粉制备步骤如下：
1)间充质干细胞的制备；
2)将hEGF基因导入步骤1)获得的间充质干细胞，得到过表达干细胞；
3)利用有限稀释法进行亚克隆，构建稳定表达hEGF的生产用干细胞；
4)进行生产用干细胞的扩增传代，并收集培养上清液，无菌分装为1ml/支，置于冻干机真空冷冻干燥，保存，即得成品。
5.根据权利要求4所述的一种用于创口皮肤修复的富含hEGF的冻干粉的制备方法，其特征在于：所述冻干粉制备步骤如下：
1)间充质干细胞的制备：
2)将hEGF基因导入步骤1)获得的间充质干细胞，得到过表达干细胞；
a)构建hEGF-pEGFP-N1真核表达质粒；
b)通过脂质体Lipofectamine2000分别包裹已构建好的hEGF-pEGFP-N1真核表达质粒，再转染至步骤1)获得的间充质干细胞中；
c)更换含800μg/mlG418的opti-MEM换液，继续培养；
d)48小时后倒置显微镜下观察，检测间充质干细胞中hEGF的表达，得到转染后的过表达干细胞；
3)利用有限稀释法进行亚克隆，构建稳定表达hEGF的生产用干细胞；
a)取步骤2)获得的过表达干细胞，0.25％胰蛋白酶进行常规消化，收集细胞悬液；
b)用血球计数板进行计数，并采用有限稀释法将细胞稀释为105个/ml，每孔接种100μl于96孔细胞培养板中，用含1600μg/mlG418选择培养基100μl/孔，进行选择培养；
c)培养7天后，再用0.25％胰蛋白酶进行消化，并扩增至24孔板；
d)进行扩增传代，并...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴金芸，徐文倩，叶华衍，张炬，雷登，
申请(专利权)人：伯仕利生物科技发展盐城有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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