稳定的调节T细胞的分离及其用途制造技术

本发明专利技术涉及分离的CD4

Isolation and application of stable regulatory T cells

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】稳定的调节T细胞的分离及其用途
本专利技术涉及稳定的调节T细胞的群体，其用途和用于鉴定、定量和分离调节T细胞的方法。
技术介绍
免疫系统保护我们人体免受外来入侵的侵害，并且传统的CD4T细胞(Tconv)在这种防御功能中是重要的。然而，在检查中必须小心地保持免疫系统，以防止其(在自身免疫疾病期间)攻击本应保护的身体或攻击无害甚至有用的微生物(例如，肠道内的细菌)。免疫系统的主要控制者是第二型CD4T细胞，称为调节T细胞(Treg)。Treg抑制免疫力，因此对于免疫耐受性，防止过度免疫和组织修复是重要的。Treg的特征由转录因子Foxp3安装。Treg有两种根本上不同的类型。胸腺(t)Treg来自胸腺中T细胞发育期间对自身反应性CD4T细胞的阳性选择。tTreg稳定地从事Foxp3的表达和Treg结局，并构成与传统T细胞不同的谱系。第二类型的Treg来自在对(外源)抗原的响应期间获得Foxp3表达并转化为Treg的成熟CD4Tconv。这些外周诱导的Treg(iTreg)是不稳定的。当暴露于炎症信号时，iTreg可能会丢失Foxp3表达并恢复Tconv的身份和功能。世界范围内做了大量的努力使用Treg治疗自身免疫性疾病(如I型糖尿病和多发性硬化症)并防止器官移植排异。为此，将Treg从供体中分离出来，在体外扩增，并注射入患者体内。当前还没有标志物允许区分(稳定的)tTreg和(不稳定的)iTreg。通常，基于CD25的高表达和CD127的缺失，目前从CD4+T细胞中分离Treg。这些分离标准导致包含污染的常规CD4+T细胞，特别是因为CD127的表达分布不是足够区分性的以严格排除Tconv。此外，Treg的CD127–CD25高群体包含稳定的tTreg和不稳定的iTreg的混合物，其后者在炎症信号的影响下可以分化为Tconv。Tconv的存在和不稳定的Treg的存在会给将Treg过继转移到患者体内的治疗中带来风险，因为这些细胞可能会攻击受体。已经确定许多功能性Treg的标志物，包括CD39、LAP和GARP。这些标志物存在于活化的Treg上，并且没有证据表明它们区分稳定Treg和不稳定Treg。此外，采用Treg进行过继细胞治疗的挑战之一是分选的Treg群体是不稳定的：在体外扩增期间，污染Tconv会使Treg过度生长，且iTreg可以失去其Treg身份。为了解决这个问题，目前在药物雷帕霉素的存在下使Treg扩展，这阻止了常规T细胞的生长，但仍然允许Treg的存活和生长。然而，尽管Treg对雷帕霉素具有相对的耐受性，但该药物的加入会抑制Treg的扩增速率，并可能改变其功能特性。此外，输注至患者中后，没有雷帕霉素用于维持选择性压力。因此，当前使用的标记物不足以纯化纯的稳定Treg，而且Treg制剂因此包括可能对受体产生有害活性的细胞。因此，仍然需要用于分离、纯化和鉴定稳定的Treg的改进方法，特别是在体外扩增后维持调节T细胞功能的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供稳定的调节T细胞群体，特别是在体外扩增后和给予患者后维持其调节T细胞功能的Treg群体。本专利技术的另外的目的是提供用于鉴定、分离、纯化和/或富集稳定的Treg的改进方法。例如，这些Treg适用于过继免疫疗法。本专利技术的另外的目的是提供方法，其中会将这种稳定的Treg用于疾病，特别是癌症和自身免疫性疾病的预后和/或诊断以及治疗反应。因此，本专利技术提供了用于富集调节T细胞的细胞群体的方法，包括：a.用能够结合GPA33的试剂接触细胞群体，b.确定所述细胞与所述能够结合GPA33的试剂的结合，和c.选择和/或分离具有高于所述细胞群体中GPA33的平均表达水平的GPA33的表达水平的CD4+T细胞。还提供了用于富集调节T细胞的细胞群体的方法，包括：a.使细胞群体与能够结合CD4的试剂和能够结合GPA33的试剂接触，和b.确定所述细胞与所述能够结合CD4和GPA33的试剂的结合，c.选择和/或分离出与所述能够结合CD4的试剂结合并具有高于所述细胞群体中GPA33的平均表达水平的GPA33的表达水平的细胞。所述调节T细胞优选是稳定的调节T细胞。进一步优选的是选择和/或分离出具有高于所述细胞群体中存在的CD4+细胞中GPA33的表达平均水平的GPA33表达水平的细胞。进一步优选的是选择和/或分离具有高于CD4+T细胞中GPA33的平均表达水平的GPA33表达水平的CD4+细胞。因此，细胞群体优选包含T细胞，更优选CD4+T细胞。所述T细胞，更优选CD4+T细胞，优选获自哺乳动物血液、滑液或淋巴液，其中所述血液优选为脐带血或外周血。进一步优选的是，选择和/或分离出的细胞是CD4+CD25+CD127-GPA33高细胞或CD4+CD25+CD127低GPA33高细胞。因此，优选的是使细胞群体进一步与能够结合CD25的试剂和能够结合CD127的试剂接触，并且选择和/或分离出与能够结合CD25的试剂结合并且基本上不与能够结合CD127的试剂结合或对能够结合CD127的试剂表现出低结合的细胞。在进一步的方面中，本专利技术提供了用于分离调节T细胞的方法，该方法包括从细胞样品中分离出CD4+GPA33高T细胞。所述调节T细胞优选是稳定的调节T细胞。进一步优选的是分离的细胞是CD4+CD25+CD127-GPA33高细胞或CD4+CD25+CD127低GPA33高细胞。在另一方面中，本专利技术提供了用于鉴定调节T细胞的方法，包括分析CD4+T细胞的GPA33的表达，其中CD4+GPA33高表达模式是调节T细胞或调节T细胞群体的指示。优选地，进一步分析CD25的表达，并且CD4+CD25+GPA33高表达模式是调节T细胞或调节T细胞群体的指示。本专利技术还提供了用于鉴定调节T细胞的方法，包括分析细胞的CD4和GPA33的表达，其中CD4+GPA33高表达模式是调节T细胞或调节T细胞群体的指示。所述调节T细胞优选是稳定的调节T细胞。进一步优选的是分离出的细胞是CD4+CD25+CD127-GPA33高细胞或CD4+CD25+CD127低GPA33高细胞。在另一方面中，本专利技术提供了用于检测调节性CD4+T细胞的方法，包括分析细胞的GPA33的表达，其中CD4+GPA33高表达模式是调节T细胞或调节T细胞群体的指示。本专利技术还提供了用于检测调节T细胞的方法，包括分析细胞的CD4和GPA33的表达，其中CD4+GPA33高表达模式是调节T细胞或调节T细胞群体的指示。在一个实施方式中，检测到的调节T细胞是稳定的调节T细胞，并且CD4+GPA33高细胞的存在是稳定的调节T细胞的指示。进一步优选的是，检测到的细胞是CD4+CD25+CD127-GPA33高或CD4+CD25+CD127低GPA33高，其表达模式是调节T细胞或调节T细胞群体的指示。在进一步的方面中，本专利技术提供了采用根据本专利技术的方法分离或获得的细胞群体。在进一步的方面中，本专利技术提供了分离的细胞群体，其中至少75％的细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于富集调节T细胞的细胞群体的方法，包括：/na.用能够结合GPA33的试剂接触细胞群体，/nb.确定所述细胞与所述能够结合GPA33的试剂的结合，和/nc.选择和/或分离具有高于所述所述细胞群体中的GPA33的平均表达水平的GPA33表达水平的CD4

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170329 EP 17163525.31.一种用于富集调节T细胞的细胞群体的方法，包括：
a.用能够结合GPA33的试剂接触细胞群体，
b.确定所述细胞与所述能够结合GPA33的试剂的结合，和
c.选择和/或分离具有高于所述所述细胞群体中的GPA33的平均表达水平的GPA33表达水平的CD4+T细胞。


2.一种用于分离调节T细胞的方法，所述方法包括从细胞样品中分离CD4+GPA33高T细胞。


3.根据权利要求1所述的方法，包括从所述样品中选择和/或分离CD4+CD25+CD127-GPA33高或CD4+CD25+CD127低GPA33高细胞。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述细胞群体或所述样品包括哺乳动物血液、滑液或淋巴液，或包括获得自哺乳动物血液、滑液或淋巴液的T细胞，其中所述血液优选是脐带血或外周血。


5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述分离或所述接触包括使所述样品或所述细胞群体与特异性结合GPA33的抗体或其抗原结合片段接触。


6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，进一步包括在一种或多种促进所述细胞的增殖、活化和/或生长的因子的存在下培养分离的细胞。


7.一种用于鉴定调节T细胞的方法，包括分析细胞的CD4和GPA33的表达，其中CD4+GPA33高表达模式是调节T细胞或调节T细胞的群体的指示。


8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述CD4+T细胞获得自肿瘤或肿瘤样品。


9.一种用于检测调节T细胞的方法，包括分析样品中的细胞的CD4和GPA33的表达，其中CD4+GPA33高表达模式是调节T细胞或调节T细胞的群体的指示。


10.根据权利要求9所述的方法，包括使所述样品与抗CD4抗体或其抗原结合片段和抗GPA33抗体或其抗原结合片段接触，并检测所述样品中的细胞与所述抗CD4抗体或其抗原结合片段和所述抗GPA33抗体或其抗原结合片段之间的结合。


11.根据权利要求9或10所述的方法，其中，所述样品是来自患有自身免疫疾病的个体，特别是患有未知的自身免疫疾病的个体的样品。


12.根据权利要求9至11中任一项所述的方法，包括定量所述样品中的CD4+GPA33高细胞的水平，优选定量CD4+CD25+GPA33高细胞的水平。


13.一种用于将自身免疫疾病分类为以调节T细胞不全为特征的自身免疫疾病的方法，所述方法包括根据权利要求11或12所述的方法定量来自患有自身免疫疾病的个体的样品中的CD4+CD25+GPA33高细胞的水平，并将所述水平与参考样品中的CD4+CD25+GPA33高细胞的水平比较，优选其中所述参考样品是来自健康个体的样品。


14.GPA33作为用于调节T细胞的标志物的用途。


15.一种用根据权利要求1-6中任一项所述的方法分离或获得的细胞群体。


16.一种分离的细胞群体，其中，至少75％的所述细胞是CD4+GPA33高调节T细胞。


17.根据权利要求16所述的细胞群体，其中，所述细胞是CD4+CD25+CD127-GPA33高细胞或CD4+CD25+CD127低GPA33高细胞。


18.一种药物组合物，包含根据权利要求15至17中任一项所述的细胞群体和药用载体、稀释剂和/或赋形剂。


19.根据权利要求15至17中任一项所述的CD4+GPA33高T细胞或细胞群体，用于疗法。


20.根据权利要求15至17中任一项所述的CD4+GPA33高T细胞或细胞群体，用于抑制免疫响应。


21.根据权利要求15至17中任一项所述的CD4+GPA33高T细胞或细胞群体，用于治疗、缓解或预防移植物抗宿主病(GVHD)、移植排异、慢性炎性疾病或自身免疫性疾病。


22.一种用于在对其有需要的受试者中抑制免疫响应的方法，包括向所述受试者给予治疗有效量的根据权利要求15至17中任一项所述的CD4+GPA33高T细胞、细胞群体或根据权利要求18所述的药物组合...

【专利技术属性】
技术研发人员：德克·阿姆森，艾洛伊·夸德拉多·戈迪亚，扬内特耶·海特勒伊达·博斯特，
申请(专利权)人：桑昆血液供给基金会，荷兰癌症研究所安东尼·范·雷文虎克医院基金会，
类型：发明
国别省市：荷兰;NL