高活性NK细胞及其应用制造技术

本发明专利技术提供细胞毒活性更高的NK细胞。本发明专利技术的课题在于提供可以期待高效果的用于NK细胞疗法的药物组合物。本发明专利技术提供具备下述(1)及(2)的特征的NK细胞或其群体：(1)CD16阳性、CD56高表达、且CD57阴性；(2)NKG2C阳性、NKG2A阴性～低表达、及CD94阳性。本发明专利技术还提供药物组合物，其包含这样的NK细胞的群体、及治疗上有效量的抗体。

High activity NK cell and its application

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】高活性NK细胞及其应用
本专利技术涉及具有高细胞毒活性的自然杀伤细胞(NK细胞)及其应用。
技术介绍
自然杀伤细胞(NK细胞)为作为自然免疫的主要因子工作的细胞毒性的淋巴细胞。已知人外周血NK细胞为CD16阳性，以低水平表达CD56，和CD57阳性(非专利文献1、2)。作为基于NK细胞细胞毒性的机制之一，已知抗体依赖性细胞毒性(Antibodydependentcellularcytotoxicity，ADCC)。NK细胞在其细胞表面上具有Fc受体(CD16)，而ADCC为NK细胞经由Fc受体与结合在靶标细胞的抗体进行结合，进行靶标细胞伤害的机制。NK细胞在肿瘤细胞、病毒感染细胞的排斥中是重要的。将从患者自身提取的NK细胞，通过体外的培养使其增殖几百倍～数千倍，使其活化，输回患者的NK细胞疗法，作为副作用比较少的治疗方法而受到关注。通常，从正常的成人的外周血进行1次单采血液成分术(apheresis)可以回收约1×1010个单核细胞，如果使外周血单核细胞中的NK细胞的构成比率为约7％，则可得到7×108个的NK细胞。另一方面，如果设患者的体重为60kg，则也就是说需要6×106个～4.8×109个NK细胞。为此，推进了将从供体得到的NK细胞进行培养扩增，而得到对使靶标细胞被杀灭而言足够的NK细胞的技术的开发。例如，专利文献1提出了NK细胞的扩增方法，其特征在于包括：制备包含NK细胞的细胞群体的步骤，和从包含NK细胞的细胞群体中除去T细胞的步骤，和对进行除去后剩余的细胞利用作为细胞因子仅包含2500IU/mL至2813IU/mL的IL-2的培养基，而不使用饲养层细胞而进行培养的步骤。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开2013-27385号公报(日本专利第5572863号)非专利文献非专利文献1：Lorenzo，M.，Blood，116：3689(2010)非专利文献2：有马靖佳，日本造血细胞移植学会杂志，第3卷，第1号：12(2014)
技术实现思路
专利技术所要解决的问题基于本专利技术人等的研究，则从外周血得到的初代NK细胞为CD16高表达，但在将NK细胞作为效应细胞(E)、K562细胞作为靶标细胞(T)而以混合比(E∶T)1∶1进行共培养的情况下，细胞毒活性为10～20％左右。希望获得细胞毒活性更高的NK细胞。另外，对众多抗体药物而言，基于NK细胞的ADCC活性为其作用机制之一。为了NK细胞发挥ADCC活性，需要存在于NK细胞表面的CD16抗体与能诱导抗体依赖性细胞毒性的抗体进行结合。然而，至今仍没有对于关于将抗体药物和NK细胞疗法有效地组合的报告。解决问题的方法[1]本专利技术提供以下内容：NK细胞或其群体，其具备下述(1)及(2)的特征：(1)CD16阳性、CD56高表达、且CD57阴性；(2)NKG2C阳性、NKG2A阴性～低表达、及CD94阳性。[2]根据1所述的群体，其包含CD16高表达的NK细胞的群体、及CD16低表达的NK细胞的群体。[3]根据1所述的NK细胞或其群体，其中CD16高表达。[4]根据1所述的NK细胞或其群体，其中CD16低表达。[5]根据1～4中任一项所述的NK细胞或其群体，其进一步具备下述(3)的特征：(3)在将该NK细胞作为效应细胞(E)、将K562细胞作为靶标细胞(T)以混合比(E∶T)1∶1进行共培养的情况下的细胞毒活性为50％以上。[6]1～5中任一项所述的NK细胞或其群体的制备方法，其包括下述：将初代NK细胞的群体利用包含IL-2的培养基、或无血清培养基进行培养的工序。[7]根据6所述的制备方法，其中，初代NK细胞的群体为经过除去CD3阳性细胞的工序的群体。[8]药物组合物，其包含根据1～5中任一项所述的NK细胞的群体、及药学上允许的添加物。[9]药物组合物，其包含NK细胞的群体、及治疗上有效量的抗体。[10]根据9所述的药物组合物，其中，NK细胞的群体为1～5中任一项所述的NK细胞的群体。[11]根据9或10所述的药物组合物，其中，抗体为能诱导抗体依赖性细胞毒性(Antibody-Dependent-Cellular-Cytotoxicity，ADCC)的抗体。[12]根据9～11中任一项所述的药物组合物，其中，抗体的至少一部分与NK细胞结合。附图说明[图1]在培养第14天的NK细胞中的主要细胞表面标记的表达。CD16的表达为双峰性。[图2A]第14天的NK细胞的来自CD56和CD16的特征表征。第14天的NK细胞中包含了CD56高/CD16高NK细胞((i)群体)和CD56高/CD16低NK细胞((ii)群体)。[图2B]第14天的NK细胞的特征。没有发现通常被作为阶段5(活化型或成熟型)的标记的CD57的表达。[图2C]第14天的NK细胞的特征。为NKG2C阳性、NKG2A阴性～低表达、CD94阳性。[图3]使用无血清、添加CTS的培养基培养的第14天的NK细胞。(i)组占全部NK细胞的比例提高了。[图4](i)组及(ii)组的细胞毒活性。(i)组、(ii)组的细胞毒活性均超过了50％。[图5](i)组及(ii)组的细胞毒活性。在达妥昔单抗添加组中，发现了更高的细胞毒活性。[图6]抗体药物+NK细胞的效果。对于莫加利珠单抗，在预混合组中发现了最高的细胞毒活性。[图7]与莫加利珠单抗进行了培养的NK细胞的分析结果。确认了NK细胞与莫加利珠单抗结合。不仅(i)组，在莫加利珠单抗为高浓度的条件下，在(ii)组也结合莫加利珠单抗。具体实施方式[NK细胞、NK细胞群体]本专利技术提供具备下述(1)的特征的NK细胞或其群体：(1)CD16阳性、CD56高表达、且CD57阴性。上述NK细胞或其群体还具备下述(2)的特征：(2)NKG2C阳性、NKG2A阴性～低表达、及CD94阳性。上述NK细胞或其群体可以进一步具备下述(3)的特征：(3)在将该NK细胞作为效应细胞(E)、将K562细胞作为靶标细胞(T)以混合比(E∶T)1∶1进行共培养的情况下的细胞毒活性为50％以上。NK细胞为不表达T细胞受体(TCR)、作为T细胞普遍的标记的CD3、及作为膜免疫球蛋白的B细胞受体的大型颗粒性淋巴细胞，通常在人中为CD16阳性、且CD56阳性。是否为NK细胞，本领域技术人员可以基于细胞表面标记的表达模式等容易地判断。NK细胞具有细胞毒活性，该细胞毒活性的有无、程度可以通过公知的各种方法测定。在称为NK细胞时，除了有特殊记载的情况以外，包括：外周血NK细胞、初代NK细胞、培养NK细胞、活化NK细胞、根据本专利技术得到的NK细胞等各种NK细胞。<细胞群体>细胞群体是指多个细胞，例如由1×105细胞以上的细胞构成本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.NK细胞或其群体，其具备下述(1)及(2)的特征：/n(1)CD16阳性、CD56高表达、且CD57阴性；/n(2)NKG2C阳性、NKG2A阴性～低表达、及CD94阳性。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170512 JP 2017-0952881.NK细胞或其群体，其具备下述(1)及(2)的特征：
(1)CD16阳性、CD56高表达、且CD57阴性；
(2)NKG2C阳性、NKG2A阴性～低表达、及CD94阳性。


2.根据权利要求1所述的群体，其包含CD16高表达的NK细胞的群体，及CD16低表达的NK细胞的群体。


3.根据权利要求1所述的NK细胞或其群体，其中CD16高表达。


4.根据权利要求1所述的NK细胞或其群体，其中CD16低表达。


5.根据权利要求1～4中任一项所述的NK细胞或其群体，其进一步具备下述(3)的特征：
(3)将该NK细胞作为效应细胞(E)、将K562细胞作为靶标细胞(T)以混合比(E∶T)1∶1进行共培养的情况下的细胞毒活性为50％以上。

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【专利技术属性】
技术研发人员：米满吉和，原田结，寺石纮司，
申请(专利权)人：盖亚生物制药有限公司，米满吉和，
类型：发明
国别省市：日本;JP