高活性NK细胞的处理方法技术

本公开的课题是提供可适用于高活性NK细胞的同时维持高生存率和高活性的冷冻保存和融解方法。一种包括以下步骤的细胞处理方法：(1)将体外活化的细胞在用于细胞培养的培养基中回收；(2)将回收的细胞在用于冷冻保存的液体中悬浮；(3)将悬浮的细胞冷冻。步骤(1)优选包括通过添加了选自由胆汁酸和苯基丁酸组成的组中的任一种的培养基的处理。的组中的任一种的培养基的处理。的组中的任一种的培养基的处理。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】高活性NK细胞的处理方法


[0001]本专利技术涉及具有高细胞毒性活性的细胞的冷冻保存方法。

技术介绍

[0002]NK细胞在肿瘤细胞和病毒感染细胞的排斥中是重要的。2017年8月嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法在美国得到承认，其以儿童和青壮年的复发
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难治性B细胞性急性淋巴细胞白血病(B
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ALL)为适应症，近年来，CAR
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NK替代CAR
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T的临床应用不断扩大(非专利文献1)。
[0003]在欲向患者施用细胞时，首先研究应用从患者自身采集的细胞，以便不引起排斥反应。但是，根据患者的状态，有时难以采集治疗所需量的细胞。此外，可在体外活化、增殖的程度有个体差异，存在增殖活化困难的情况。而且，由于细胞的活化
·
增殖需要一定时期，存在不能立即开始治疗的问题。在这方面，如果可以预先活化细胞、以供施用且保存，则是期望的。
[0004]作为保存细胞的方法，已知在短时间保存的情形中不进行冷冻以悬浮状态保存的方法(例如，专利文献1)，此外，已知在长时间保存的情形中进行冷冻的保存方法(例如，专利文献2)。作为进一步将细胞冷冻、得到在融解后也维持高生存率的细胞，研究了应用含有钠盐、钾盐、糖、防冻剂、以及碳酸氢盐和/或碳酸盐的用于冷冻的溶液(专利文献3)。
[0005]现有技术文献
[0006]专利文献
[0007]专利文献1：特开2006
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230396号公报
[0008]专利文献2：特开2002
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233356号公报
[0009]专利文献3：WO2011/021618
[0010]非专利文献
[0011]非专利文献1：Liu E，et al.N Engl J Med.2020；382：545
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53
[0012]专利技术概述
[0013]专利技术要解决的课题
[0014]但是，对于应用以往的如二甲亚砜的保护剂的冷冻方法，可以保存T细胞系和原代NK细胞，但对细胞毒性活性高的NK细胞是不足的，通过冷冻融解操作，其活性和生存率显著降低。这不能用程序冷冻、细胞密度调节、葡聚糖、白蛋白、或羧化聚
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L
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赖氨酸等的添加等解决。然后以一定量的细胞死亡为前提进行用于施用的细胞的包装时，融解后需要用于再活化培养的步骤，得到的细胞需要进一步洗涤。因此存在下列现状，冷冻的、储存的高活性NK细胞只能在符合处理临床用细胞的细胞培养加工设备(CPC)的基准的设备中利用。
[0015]本专利技术的课题是提供可适用于高活性NK细胞的维持高生存率和高活性的冷冻保存、融解方法。
[0016]用于解决课题的手段
[0017]本专利技术提供以下各项。
[0018][1]细胞的处理方法，其包括以下步骤：
[0019](1)将体外活化的细胞在用于细胞培养的培养基中回收；
[0020](2)将回收的细胞在用于冷冻保存的液体中悬浮；
[0021](3)将悬浮的细胞冷冻。
[0022][2][1]中记载的方法，其中，步骤(1)包括通过添加了选自由胆汁酸和苯基丁酸组成的组中的任一种的培养基的处理。
[0023][3][1]或[2]中记载的方法，其进一步包括以下步骤：
[0024](4)将冷冻保存的细胞融解、在融解溶剂I中悬浮。
[0025][4][1]～[3]的任一项中记载的方法，其中，融解溶剂I是包含以下的水溶液：
[0026]·
氯化钠9.00～108mM、
[0027]·
葡萄糖酸钠2.30～27.7mM，
[0028]·
醋酸钠2.70～32.5mM，
[0029]·
氯化钾0.496～5.96mM，和
[0030]·
氯化镁0.148～1.78mM。
[0031][5][1]～[4]的任一项中记载的方法，其中，融解溶剂I满足以下至少一项：
[0032]·
不含0.423mM以上的浓度的钙离子，
[0033]·
不含5.55mM以上的浓度的葡萄糖，和
[0034]·
不含27.7mM以上的浓度的乳酸盐。
[0035][6]用于悬浮高活性NK细胞的液体，其包含以下：
[0036]·
氯化钠9.00～108mM，
[0037]·
葡萄糖酸钠2.30～27.7mM，
[0038]·
醋酸钠2.70～32.5mM，
[0039]·
氯化钾0.496～5.96mM，和
[0040]·
氯化镁0.148～1.78mM。
[0041][7][6]中记载的液体，其用于悬浮用于冷冻保存的液体中悬浮冷冻的高活性NK细胞。
[0042][8]药物组合物，其包含高活性NK细胞、用于冷冻保存的液体、和[6]中记载的液体。
[0043][9]包含细胞的药物组合物的制备方法，其包括以下步骤：
[0044](1)将体外活化的细胞在用于细胞培养的培养基中回收；
[0045](2)将回收的细胞在用于冷冻保存的液体中悬浮；
[0046](3)将悬浮的细胞冷冻。
[0047][10][9]中记载的制备方法，其中，步骤(1)包括通过添加了选自由胆汁酸和苯基丁酸组成的组中的任一种的培养基的处理。
[0048]附图简述
[0049][图1
‑
1]Mito
‑
FerroGreen反应后的各种细胞的流式细胞仪分析结果。高活性NK细胞的铁含量多，怀疑可能引起Ferroptosis诱导。
[0050][图1
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2]高活性NK细胞的冷冻融解时的光学显微镜照片。MP：甲基强的松龙、Dex：地塞米松。确认高活性NK细胞的冷冻融解下活力显著降低。
[0051][图1
‑
3]高活性NK细胞的融解时的活力。融解时用Plasma
‑
Lyte A稀释时活力改善。但是，在向KBM501培养基添加葡萄糖酸的情形中，未见到改善。Lacto＝乳酸林格(lactoringer)
[0052][图1
‑
4]图1
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3的延续
[0053][图2]高活性NK细胞的融解时的活力。融解时用Plasma
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Lyte A稀释时活力改善，但用包含40％血清(人AB型血清)的Plasma
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Lyte A稀释时活力变差。
[0054][图3]高活性NK细胞的规定时间静置后的活细胞数和活力(右)与细胞毒性活性(左)。Plasma＝Plasma
‑
Lyte A
[0055][图4]高活性NK细胞的冷冻预处理的影响。通过冷冻前用添加4
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.细胞的处理方法，其包括以下步骤：(1)将体外活化的细胞在用于细胞培养的培养基中回收；(2)将回收的细胞在用于冷冻保存的液体中悬浮；(3)将悬浮的细胞冷冻。2.权利要求1中所述的方法，其中，步骤(1)包括通过添加了选自由胆汁酸和苯基丁酸组成的组中的任一种的培养基的处理。3.权利要求1或2中所述的方法，其进一步包括以下步骤：(4)将冷冻保存的细胞融解，将融解的细胞悬浮于融解溶剂I。4.权利要求1～3的任一项中所述的方法，其中，融解溶剂I是包含以下的水溶液：5.权利要求1～4的任一项中所述的方法，其中，融解溶剂I满足以下至少一项：
·
不含0.423mM以上的浓度的钙离子，
·
不含5.5...

【专利技术属性】
技术研发人员：原田结，米满吉和，
申请(专利权)人：盖亚生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：