桦褐孔菌菌种超低温保藏技术制造技术

本发明专利技术公开了桦褐孔菌菌种超低温保藏菌种方法，属于药食两用真菌及生物工程应用领域。本发明专利技术公开了采用固液菌种转换技术超低温保藏桦褐孔菌菌种的方法，即以固体菌种作为菌种保藏的主体，将其放入装有玻璃珠的无菌水中，在混匀仪上振荡，让高速旋转的玻璃珠击碎固体菌种，使掉落的菌丝体碎片和片段悬浮在无菌水中，完成菌种的固液转换。采用本发明专利技术公开的保藏方法复活桦褐孔菌，能保证菌种活性及其生物学特性仍然保持着保藏前的初始状态。本发明专利技术为桦褐孔菌的菌种保藏提供了一种科学可靠的技术途径。的技术途径。的技术途径。

【技术实现步骤摘要】
桦褐孔菌菌种超低温保藏技术


[0001]本专利技术属于药食两用真菌及生物工程应用领域，具体涉及一种桦褐孔菌菌种超低温保藏菌种方法。

技术介绍

[0002]桦褐孔菌[Inonotus obliquus(Pers.: Fr.) Pilat]，又名斜生纤孔菌、桦癌孔菌、白桦茸等。属担子菌亚门、层菌纲、无褶菌目、多孔菌科，是一种能促进木质素、纤维素、半纤维素降解的白腐真菌。主要分布在北半球北纬40
°
至50
°
地区，如北美、波兰、芬兰、俄罗斯、日本北海道等国家和地区。我国主要分布在吉林长白山地区、黑龙江大小兴安岭以及内蒙古自治区等地。桦褐孔菌是一种珍贵的药用真菌，东欧及俄罗斯地区民间很早就广泛利用桦褐孔菌来治疗如糖尿病、心脏病及各种癌症。随着人们对桦褐孔菌药理及生理生化研究的深入，发现桦褐孔菌具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗炎、调节血糖、血脂、血压、胃肠道机能和提高机体免疫功能等多方面的活性，是一个不可多得的天然药食两用真菌。
[0003]桦褐孔菌突出的药理及保健活性功效引起了科研工作者的广泛关注，并对桦褐孔菌的生物学特性、栽培方法、桦褐孔菌的化学成份及其药理作用，桦褐孔菌多糖的抗肿瘤活性、桦褐孔菌深层发酵、及其菌丝体的活性成份与野生菌丝体组成变化情况都进行了广泛深入的研究，科研人员根据桦褐孔菌的多种药理作用及功效，已开发出食品、保健饮料、茶剂、桦褐孔菌精粉等产品。在俄罗斯、芬兰的民间，人们使用桦褐孔菌作为抗癌药物、滋补剂、血液清洁剂和疼痛缓解剂，直到今天，一种被称为“befungin”的褐色液体仍在使用。然而由于野生桦褐孔菌子实体稀少，人工栽培不成熟，野生的桦褐孔菌只有在活的桦树上生长10
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15年才具有很好的药用价值，价格十分昂贵，因此，美国、日本、韩国已加大了对桦褐孔菌的研究力度，我国对桦褐孔菌的研究相对还比较薄弱，主要集中在三萜类化学成份的研究上。
[0004]桦褐孔菌的菌种是我们研究开发桦褐孔菌最基础也是最重要的物质条件，由于桦褐孔菌种自身的生物学特性，菌丝在生长过程中极易产生粉状孢子，并很快老化，尤其是高温培养时极易产生粉孢子，进而引起老化发黄和菌种退化，对我们研究桦褐孔菌会产生很大的困扰。为了能给桦褐孔菌的科学研究提供活性强，生长旺盛，品质及遗传特性稳定的优良原始菌种，我们不能再使用常规的如琼脂菌种保藏方法、木屑菌种保藏方法等。因为这些常规的菌种保藏方法只能在短期内保持菌种的活性，无法长时间保持菌种活性及遗传物质不发生变异。

技术实现思路

[0005]针对上述问题，本专利技术提供一种桦褐孔菌菌种超低温保藏菌种方法。所述方法为采用超低温
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80℃冰箱保藏桦褐孔菌菌种，实验表明
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80℃超低温冰箱保藏的桦褐孔菌菌种重新复活后菌种活性及其生物学特性仍然保持着保藏前的初始状态。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案。
[0007]本专利技术提供了一种桦褐孔菌菌种超低温保藏方法，其特征在于，所述方法为采用固液菌种转换技术超低温保藏桦褐孔菌菌种。
[0008]本专利技术提供了一种桦褐孔菌菌种超低温保藏方法，其特征在于，包括以下具体步骤：步骤1准备固体菌种：在固体菌种培养基接上桦褐孔菌琼脂培养基的菌种，培养至长满菌丝后备用；步骤2固液菌种转换：在超净工作台上用接种针取出步骤1中所制备的菌种中的前部1cm长段弃之不用，然后再取出1cm后面的菌种约1cm长度，放入事先灭菌的玻璃珠及纯净水的离心管中；混匀仪上振荡混合至悬浮在水中的菌丝片段是理想的菌丝状态；步骤3冻存管内加注步骤2制备的桦褐孔菌菌种：先摇晃离心管，使沉底的菌丝片段悬浮在无菌水中，从离心管中取900μL桦褐孔菌液体菌种迅速注入含有保存液且已灭菌的冻存管内，并密封盖子后放回到冻存盒中；步骤4步骤3中制备的冻存管混匀：步骤3中冻存管在放入超低温冰箱前需要用混匀仪振荡，摇匀里面的菌种和保护剂，使菌种和保护剂充分混匀，以使保护剂起到最佳的保护效果；步骤5准备程序降温盒：程序降温盒在装冻存管进入超低温冰箱前，要提前从冰箱中取出，放在室温下使内部的冻存液温度下降到25℃左右；步骤6
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80℃超低温冰箱冻存：冻存管在装入程序降温盒前要先贴上标签，注明菌种名称、保护剂名称、保护剂浓度、存入日期等内容；菌种贴标后就可放入程序降温盒，然后把程序降温盒放入
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80℃超低温冰箱中冷冻保存；步骤7转入冻存盒
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80℃长期保藏：经过24h的
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80℃超低温冷冻，此时程序降温盒内的菌种温度已经达到
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80℃；此时需要把程序降温盒中的冻存管取出插入冻存盒内，冻存盒上也要贴上标签，注明盒序号、存入菌种名称、数量、时间等信息；冻存盒放入
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80℃超低温冰箱中长期保存。
[0009]进一步地，步骤1中所述固体菌种培养的组方如下：麦粒85%，桦木屑14%，石灰0.5%，石膏0.5%。
[0010]进一步地，步骤1中所述培养条件为：接种琼脂培养基上桦褐孔菌菌种至固体培养基中，20℃恒温箱培养30d备用。
[0011]进一步地，步骤2中所述玻璃珠的直径为3.5
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6.5mm，所述纯净水25
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28mL。
[0012]进一步地，步骤2中所述理想的菌丝状态为混合振荡至麦粒表面光滑、附着在麦粒上的木屑和菌丝掉落到无菌水中，并且由大块菌丝变成小块菌丝，甚至是菌丝片段。
[0013]进一步地，步骤3中所述冻存管中含有10%的二甲基亚砜保护剂。
[0014]本专利技术还提供了一种按照上述所述的保藏方法保藏的桦褐孔菌株复活方法，其特征在于，具体步骤包括：步骤1快速解冻：从冰箱中取出按照权利要求1所述的保藏方法保藏的桦褐孔菌株后，迅速解冻；步骤2涂琼脂平皿：步骤1中解冻后的冻存管菌种要立刻进行涂平板，用微量取液器取出低温保藏的液体菌涂平皿；步骤3恒温培养：平板接种完液体菌种后，要用封口膜把平皿包好，注明菌种名称
及培养开始日期，倒置放入20℃生化培养箱中恒温培养。
[0015]进一步地，所述步骤1中迅速解冻的时间要在40
‑
50s内，才能保护菌种的细胞不受低温损害。
[0016]与现有技术相比本专利技术的有益效果。
[0017]（1）直接使用麦粒木屑菌种作为菌种保藏的主体。通常超低温保藏菌种都是使用液体菌种作为菌种保藏的主体，这类菌种往往液体菌种比较容易得到，且液体菌种长势旺盛，活性较强。而对于另外一类菌其固体菌种活力较强，生长比较旺盛，液体菌种相对较弱，因此对于这类菌株使用固体菌种作为菌种保藏的主体就能较好地保持该菌株遗传性状的稳定。由于固体菌种无法直接进行菌种的超低温保藏，需要将其转换成液体菌种状态才能进行超低温保藏。因此本专利技术采用了固液菌种转换技术，将固体菌种放入装有玻璃珠的无菌水中，在混匀仪上振荡，让高速旋转的玻璃珠击碎固体菌种，使掉落的菌丝体碎片和片段悬浮在无菌水中，完成菌种本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种桦褐孔菌菌种超低温保藏方法，其特征在于，所述方法为采用固液菌种转换技术超低温保藏桦褐孔菌菌种。2.一种桦褐孔菌菌种超低温保藏方法，其特征在于，包括以下具体步骤：步骤1准备固体菌种：在固体菌种培养基接上桦褐孔菌琼脂培养基的菌种，培养至长满菌丝后备用；步骤2固液菌种转换：在超净工作台上用接种针取出步骤1中所制备的菌种中的前部1cm长段弃之不用，然后再取出1cm后面的菌种约1cm长度，放入事先灭菌的玻璃珠及纯净水的离心管中；混匀仪上振荡混合至悬浮在水中的菌丝片段是理想的菌丝状态；步骤3冻存管内加注步骤2制备的桦褐孔菌菌种：先摇晃离心管，使沉底的菌丝片段悬浮在无菌水中，从离心管中取900μL桦褐孔菌液体菌种迅速注入含有保存液且已灭菌的冻存管内，并密封盖子后放回到冻存盒中；步骤4步骤3中制备的冻存管混匀：步骤3中冻存管在放入超低温冰箱前需要用混匀仪振荡，摇匀里面的菌种和保护剂，使菌种和保护剂充分混匀，以使保护剂起到最佳的保护效果；步骤5准备程序降温盒：程序降温盒在装冻存管进入超低温冰箱前，要提前从冰箱中取出，放在室温下使内部的冻存液温度下降到25℃左右；步骤6
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80℃超低温冰箱冻存：冻存管在装入程序降温盒前要先贴上标签，注明菌种名称、保护剂名称、保护剂浓度、存入日期等内容；菌种贴标后就可放入程序降温盒，然后把程序降温盒放入
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80℃超低温冰箱中冷冻保存；步骤7转入冻存盒
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80℃长期保藏：经过24h的
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80℃超低温冷冻，此时程序降温盒内的菌种温度已经达到
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80℃；此时需要把程序降温盒中的冻存管取出插...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓春海，池景良，朱巍巍，徐冲，柴林山，孟庆国，王艳华，
申请(专利权)人：辽宁省微生物科学研究院，
类型：发明
国别省市：