一种筛选肿瘤特异性T细胞及TCR的方法技术

本公开提供了一种筛选肿瘤特异性T细胞及TCR的方法，具体步骤为：(1)首先将肿瘤组织进行浸润单细胞消化分离；(2)然后从分离的单细胞中流式分选出CD3

A method of screening tumor specific T cells and TCR

【技术实现步骤摘要】
一种筛选肿瘤特异性T细胞及TCR的方法
本公开涉及生物
，具体涉及一种筛选肿瘤特异性T细胞及TCR的方法。
技术介绍
目前传统手术、放疗和化疗无法彻底清除肿瘤细胞，无法解决肿瘤转移复发的问题。免疫系统对突变细胞和肿瘤细胞执行监视、清除、调节和免疫记忆功能，通过免疫疗法激活患者自体免疫系统，依靠自身的免疫机能杀灭肿瘤细胞，因而能防止肿瘤的复发和转移。随着近年肿瘤免疫治疗方面的研究突飞猛进，人们攻克癌症的梦想已越来越近，嵌合抗原受体T细胞疗法(ChimericAntigenReceptor-ModifiedTCells，CAR-T)可以治愈90％的白血病，PD-1/CTLA-4抗体通过调节T细胞功能使免疫正常化，极大提高了多种实体瘤的缓解率和5年生存率，并获2018年诺贝尔生理医学奖。因而，越来越多的学者坚信，免疫治疗将是人类战胜肿瘤的终极武器。免疫系统对肿瘤细胞的识别和清除主要依赖T细胞介导的细胞免疫，通过增强抗肿瘤细胞免疫反应，修复机体免疫监视、防御和调控功能的过继T细胞(adoptivecelltransfertherapy，A本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种筛选肿瘤特异性T细胞及TCR的方法，其特征在于，所述方法具体步骤为：/n(1)首先将肿瘤组织进行浸润单细胞消化分离；/n(2)然后从分离的单细胞中流式分选出CD3

【技术特征摘要】
1.一种筛选肿瘤特异性T细胞及TCR的方法，其特征在于，所述方法具体步骤为：
(1)首先将肿瘤组织进行浸润单细胞消化分离；
(2)然后从分离的单细胞中流式分选出CD3+T细胞；
(3)利用免疫磁珠去除流式分选出CD3+T细胞中的死细胞；
(4)将去除死细胞后的CD3+T细胞进行单细胞转录组建库、VDJ建库及测序；
(5)将测序后的数据进行分析，然后筛选肿瘤特异CD8+T细胞及TCR。


2.根据权利要求书1中所述的筛选肿瘤特异性T细胞及TCR的方法，其特征在于，所述步骤(1)的具体操作步骤为：
(a)首先将离体手术切除肿瘤组织置于无菌平皿内，利用无菌PBS或Hank’s溶液将肿瘤组织进行反复冲洗，并减去结缔组织和脂肪组织，然后将肿瘤组织剪碎；
(b)在剪碎的肿瘤组织中加入组织消化液混匀于37℃摇床消化1-2h；
(c)将消化后的肿瘤组织中加入HBSS溶液终止消化，使用移液管将组织液转移至70μm筛网中过滤至离心管中，1800r/min，离心8min；
(d)将离心后的组织液弃去上清液，用Hank’s溶液洗涤，然后离心弃掉上清液，加入培养液重悬细胞，计数细胞。


3.根据权利要求书1中所述的筛选肿瘤特异性T细胞及TCR的方法，其特征在于，所述步骤(2)的具体操作步骤为：
①将计数为10-50×106个组织浸润单个核细胞，离心后弃掉上清，用纯化缓冲液清洗，然后1800rpm/min4℃离心8min；
②将离心后的上清液弃掉，用200μL纯化缓冲液将沉淀细胞重悬，加入荧光抗体，4℃避光孵育30min后，用纯化缓冲液清洗，然后1800rpm/min4℃离心8min，弃掉上清，用500μL纯化缓冲液将沉淀细胞重悬；
③将细胞重悬液经40μm的筛网过滤去除粘连的细胞团块，然后将过滤的细胞重悬液经7-AAD染料进行表面分子染色，利用BDAriaII收集射门于单细胞中的7-AAD-CD45-V450+CD3-PE-CF594+细胞群。


4.根据权利要求书1中所述的筛选肿瘤特异性T细胞及TCR的方法，其特征在于，所述步骤(3)的具体操作为：将流式分选的CD3+T细胞进行离心，然后用无菌PBS洗涤，然后取45-55μL无菌PBS重悬细胞，取等量的细胞悬液和胎盘蓝混合，利用LifeCount细胞计数仪计数细胞及细胞活率，细胞活率<80％利用美天旎磁珠去死细胞磁珠做去死细胞处理。

【专利技术属性】
技术研发人员：罗微，毛晓帆，余思菲，张贝莹，林凯容，金亚彬，
申请(专利权)人：佛山市第一人民医院中山大学附属佛山医院，
类型：发明
国别省市：广东;44