一种肿瘤抗原特异性TCR序列的筛选方法技术

本发明专利技术提供了一种肿瘤抗原特异性TCR序列的筛选方法。所述筛选方法包括步骤：获取同源的肿瘤组织和转移淋巴结组织；制备单细胞悬液，进行转录组建库、VDJ建库及测序，从测序结果中选取第一备选TCR序列集合和第二备选TCR序列集合；同时满足第一备选TCR序列集合和第二备选TCR序列集合的即为所述肿瘤抗原特异性TCR序列。所述方法针对每例患者，在其肿瘤抗原未知的情况下，筛选出其肿瘤抗原特异性TCR序列，通过人工合成该肿瘤抗原特异性TCR的片段并插入患者外周血杀伤性T细胞中，使得外周血T细胞具有杀伤肿瘤的能力，经过体外扩增后回输给患者以杀伤肿瘤。给患者以杀伤肿瘤。

【技术实现步骤摘要】
一种肿瘤抗原特异性TCR序列的筛选方法


[0001]本专利技术涉及生物检测
，特别涉及一种肿瘤抗原特异性TCR序列的筛选方法。

技术介绍

[0002]近年来，阻断针对细胞毒性T淋巴细胞相关抗原
‑
4(CTLA
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4)、程序性死亡
‑
1(PD
‑
1)和程序性死亡配体
‑
1(PD
‑
L1)的单克隆抗体可以恢复预先存在的抗癌免疫，并在各种类型的实体肿瘤中获得持久的临床反应。这些免疫检查点抑制剂的成功证明了恶性肿瘤患者存在抗癌免疫。另一方面肿瘤浸润T细胞（TIL）与预后相关性研究指出，CD8毒性TIL与CD4辅助TIL都显著提高了癌症的总生存率。这些研究指出了肿瘤的免疫治疗具有巨大的潜在价值。
[0003]然而，并非所有的肿瘤对检查点阻断治疗都能有好的响应效果，例如乳腺癌。与高免疫原性的癌症（如黑色素瘤和非小细胞肺癌）相比，乳腺癌的肿瘤突变负荷较低及其免疫原性较差。单纯的免疫检查点阻断治疗，并不能获得广泛的疗效。三阴性乳腺癌（TNBC），作为免疫源性最高的乳腺癌亚型，常作为免疫检查点阻断治疗的对象。多个临床研究表明，免疫检查点阻断转移性TNBC的客观缓解率（ORR,objective response rate）均介于4.7%
‑
24%，其ORR高低取决于PD
‑
L1的表达量、一线或者二线治疗以及淋巴细胞浸润程度。总体而言，其响应率都较低。对于一线治疗及PD
‑
L1阳性的TNBC患者，免疫检查点阻断治疗才显得有效。故乳腺癌患者接受免疫检查点阻断治疗的受众非常局限。
[0004]免疫检查点阻断治疗从细胞学机制上讲，可扭转毒性CD8
+
T淋巴细胞耗竭，增强其效应功能，从而达到杀伤肿瘤的作用。但是同时也有研究指出，T细胞的耗竭可通过多个机制达成，单一阻断PD
‑
1仍会激活其他机制，同样导致T细胞的耗竭。从另一方面讲，CD4
+
调节性T细胞（Treg）的功能也有可能被上调。已有研究指出PD
‑
1的阻断可增强Treg的功能，从而限制CD8
+
T细胞的功能，导致肿瘤进展。临床研究中，还有观察到阻断PD
‑
1可导致肿瘤超进展（tumor hyper
‑
progression）的情况，尤其在年龄大于65岁的患者中出现的频率较高。故单纯的免疫检查点阻断，很多情况下可能无法达到很好的治疗效果。
[0005]近年来，T细胞受体基因修饰T细胞（TCR
‑
T）的治疗方法被广泛关注。而TCR
‑
T在实体瘤中展现了一些特有的优势，其中包括：1）通过MHC的提呈，TCR
‑
T细胞可以识别胞内和细胞表面蛋白，尤其是突变后被MHC提呈的蛋白片段，而CAR
‑
T细胞只能识别细胞表面蛋白，这使得TCR
‑
T识别肿瘤细胞具有更高的特异性与灵敏度；2）因为它保留了所有TCR信号转导通路的辅助分子，当有少量抗原存在时，TCR
‑
T细胞可完全激活，产生杀伤作用；3）TCR可以识别肿瘤细胞内部分子，而对TCR进行基因编辑可提高对肿瘤细胞的亲和力；4）结合近年来高速发展的高通量单细胞技术，可以实现多靶点识别，降低由于靶点单一而导致的肿瘤复发率；5）若利用患者自体TCR序列，如参与外周循环及淋巴循环的TCR，实施个性化TCR
‑
T治疗，则可以避免对正常细胞的杀伤副作用。
[0006]目前，人们对肿瘤特异TCR的认识还非常不足。大多数临床TCR
‑
T试验是人类白细胞抗原（HLA
‑
）A1和A2限制的，直接针对分化、癌胚或癌种系抗原。总的来说，这些试验已经
证明转移性黑色素瘤、结直肠癌和滑膜肉瘤患者有显著的临床反应。这种TCR
‑
T治疗一般先确定肿瘤抗原，或依靠癌细胞种系，或预测肿瘤新抗原，通过亲和力计算及体外试验确定TCR序列，以应对具有相似情况的多个患者。但实际上，患者多样化，肿瘤异质性高，而这种TCR
‑
T并不具有以不变应万变的能力，所以适合该方法治疗的患者并不多。
[0007]近年来，随着对肿瘤微环境的不断探索，及单细胞多组学的发展，使得个性化定制肿瘤患者的TCR
‑
T治疗成为了可能。其原理是从患者自身寻找肿瘤特异T细胞，人工合成其TCR序列，并插入该患者外周血杀伤性T细胞中，使得外周血T细胞具有杀伤肿瘤的能力，经过体外扩增后回输给患者以杀伤肿瘤。通过批量合成多条序列，还可以达到多靶点杀伤肿瘤的效果。
[0008]但是，个性化TCR
‑
T的治疗方法还存在一些问题，例如需首先获取肿瘤抗原，再获取肿瘤特异T细胞，技术步骤繁琐易出错，且无法获得表达该TCR的细胞属于何种状态、何种亚群以及表达何种效应因子，其肿瘤反应性也无法得知，故不利于对TCR序列应用于TCR
‑
T的有效性的评估。

技术实现思路

[0009]本专利技术目的在于提供一种肿瘤抗原特异性TCR序列的筛选方法，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，提供至少一种有益的选择或创造条件。
[0010]本专利技术的一方面在于提供了一种肿瘤抗原特异性TCR序列的筛选方法。所述筛选方法包括以下步骤：（1）获取同源的肿瘤组织和转移淋巴结组织；（2）使用肿瘤组织制备单细胞悬液，进行转录组建库、VDJ建库及测序，从测序结果中选取克隆频率>0.5%的CD8
+
T细胞的TCR序列作为第一备选TCR序列集合；（3）使用转移淋巴结组织制备单细胞悬液，进行转录组建库、VDJ建库及测序，从测序结果中选取克隆频率>0.5%的CD8
+
T细胞的TCR序列作为第二备选TCR序列集合；（4）同时满足第一备选TCR序列集合和第二备选TCR序列集合的即为所述肿瘤抗原特异性TCR序列。
[0011]步骤（2）和（3）可以同时实施，也可以交换实施顺序。
[0012]基于单细胞测序获得肿瘤特异TCR的方法，由于肿瘤组织中存在非特异扩增的效应CD8
+
T细胞，很难从细胞转录组特征上区分肿瘤特异与旁观者（bystander）效应T细胞。单单利用肿瘤组织难以筛选出准确的靶向肿瘤的TCR序列，因此本筛选方法同时还以转移淋巴结组织进行测序。同源的肿瘤组织和转移淋巴结组织位点都出现了相同的抗原，才能导致具有相同的T细胞克隆增殖。那么靶向这种抗原的TCR序列，是可以同时靶向转移灶与原发灶的肿瘤细胞，可降低由于肿瘤异质性，尤其是易转移肿瘤细胞与原发灶肿瘤细胞异质性而导致的脱靶效应。
[0013]在一些实施方式中，所述转移淋巴结组织或肿瘤组织的获取步骤包括：a)组织破碎成组织块；优选地，所述组织经过反复冲本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肿瘤抗原特异性TCR序列的筛选方法，其特征在于，包括步骤：获取同源的肿瘤组织和转移淋巴结组织；使用肿瘤组织制备单细胞悬液，进行转录组建库、VDJ建库及测序，从测序结果中选取克隆频率>0.5%的CD8
+
T细胞的TCR序列作为第一备选TCR序列集合；使用转移淋巴结组织制备单细胞悬液，进行转录组建库、VDJ建库及测序，从测序结果中选取克隆频率>0.5%的CD8
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T细胞的TCR序列作为第二备选TCR序列集合；同时满足第一备选TCR序列集合和第二备选TCR序列集合的即为所述肿瘤抗原特异性TCR序列。2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述转移淋巴结组织或肿瘤组织的获取步骤包括：a)组织破碎成组织块；优选地，所述组织经过反复冲洗后剪碎成组织块；优选地，所述组织块的体积为1~2mm3；b)使用组织消化液消化所述组织块；优选地，向组织块加入组织消化液，混匀，摇床消化；优选地，所述摇床消化是35~40℃摇床中消化1~2小时；c)终止消化，将消化处理后的组织液以70μm的筛网过滤至新的离心管中，离心，弃去上清液；d)用平衡盐溶液洗涤，弃上清，加入培养液重悬细胞；优选地，所述洗涤次数至少两次。3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤b)所述组织消化液包括I型胶原酶、DNA酶和RPMI1640培养基；优选地，所述组织消化液包括10~50 mg I型胶原酶、10~50 μL浓度为10 mg/mL的DNA酶、10~5...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗微，毛晓帆，官展文，余思菲，
申请(专利权)人：佛山市第一人民医院中山大学附属佛山医院，
类型：发明
国别省市：