一种提高哺乳动物胚胎体外存活率的培养方法技术

本发明专利技术公开了一种提高哺乳动物胚胎体外存活率的培养方法，包括以下步骤：（1）从母羊身上取得羊卵母细胞置入成熟培养液内，在培养箱内培养20‑24小时，获得成熟的羊卵母细胞；（2）将成熟的羊卵母细胞与精子一同放入受精培养液中，在培养箱内培养18‑24小时，进行受精，获得早期羊胚胎；（3）将受精后的羊胚胎用TCM199培养液进行反复冲洗，之后放入羊胚胎体外培养液中，并置入培养箱中进行胚胎体外培养，该培养箱内温度维持在38‑39℃，气体浓度维持在5%CO2；其中，上述培养箱包括培养室、室门、与该培养室相连通的气体浓度调节室；所述培养室内具有多个培养仓，多个培养仓内分别上设有培养基放置架和隔断装置。本发明专利技术的培养箱内环境的稳定性，保障胚胎的存活率。

A culture method for improving the survival rate of mammalian embryos in vitro

【技术实现步骤摘要】
一种提高哺乳动物胚胎体外存活率的培养方法
本专利技术属于羊胚胎体外培养
，尤其是涉及一种提高哺乳动物胚胎体外存活率的培养方法。
技术介绍
胎体外培养是指把胚胎放在培养箱中，培养箱中保持恒定的温度和恒定浓度的二氧化碳，模拟子宫的生理环境，培养基中的胚胎与之互相作用和交换物质，进而实现胚胎生长。现有的培养方法中，胚胎放入至培养箱内后，操作人员需要经常对胚胎进行观察或者进行操作，此时均需要打开培养箱的箱门，进而在操作过程中，箱体内的环境将与外界空气进行气体交换，使得箱体内的环境受到影响而发生变化，难以保证培养箱内始终维持在稳定的温度和气氛环境内，胚胎易出现损伤或死亡的情况，胚胎存活率低。
技术实现思路
本专利技术为了克服现有技术的不足，提供一种存活率高的提高哺乳动物胚胎体外存活率的培养方法。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种提高哺乳动物胚胎体外存活率的培养方法，包括以下步骤：（1）从母羊身上取得羊卵母细胞置入成熟培养液内，在培养箱内培养20-24小时，获得成熟的羊卵母细胞；（2）将成熟的羊卵母细胞与精子一同放入受精培养液中，在培养箱内培养18-24小时，进行受精，获得早期羊胚胎；（3）将受精后的羊胚胎用TCM199培养液进行反复冲洗，之后放入羊胚胎体外培养液中，并置入培养箱中进行胚胎体外培养，该培养箱内温度维持在38-39℃，气体浓度维持在5%CO2；其中，上述培养箱包括培养室、与该培养室相配合的室门、与该培养室相连通的气体浓度调节室；所述培养室内具有多个培养仓，多个培养仓内分别上设有培养基放置架和隔断装置，所述培养基放置架可插入至培养仓内，且插入后培养基放置架与培养仓的进口处密封配合；上述培养步骤过程中需要对培养箱内的不同位置上胚胎进行观察时，操作者可将培养基放置架由独立的培养仓中抽出，并且培养基放置架被抽出的过程中，所述隔断装置将隔断对应培养仓与外界的连通。本专利技术中培养箱内的各个培养仓为单独设置，且当培养仓内的放置架被向外抽出时，隔断装置始终能够隔断培养仓与外界的连通，进而在对胚胎进行观察时，仅被抽出的放置架上的培养基会短暂的与外界空气接触，而其余位置的培养基均不会与外界空气接触，且通过隔断装置进行隔断后，外界空气也不会由打开的培养仓进入至整个气体浓度调节室内，同样避免其他位置的培养仓受到外界环境的影响，提升培养箱内环境的稳定性，保障胚胎的存活率；多个培养仓均与气体浓度调节室相连通，进而气体浓度调节室内调节完成后的气体能够直接输送至培养仓内，进而无需针对每个培养仓单独设置气体浓度检测器和进气管道，结构更为简单，气体调节更为快速。步骤（1）中培养箱内的温度维持在38-39℃，气体浓度维持在5%CO2；该种温度和气体浓度下，胚胎处于最为适合生产的环境下，生长速度快，存活率高。上述步骤（2）中的受精培养液为含3%羊血清的TCM199培养液。所述隔断装置包括可前后动作的设于培养仓内的移动板、设于移动板外侧壁上与培养仓内壁密封配合的一圈密封件、设于移动板上的单向出气部件和单向进气部件、导通部件及用于实现培养基放置架和移动板之间的连接配合的连接结构；当培养基放置架插入至培养仓内时，培养基放置架抵触移动板向后移动，同时单向进气部件控制气体浓度调节室内的气体单向进入至培养仓内；当移动板移动至最后端位置时，连接结构实现培养基放置架和移动板之间的连接配合，同时导通部件实现培养仓与气体浓度调节室的直接连通；当需要对培养仓内的培养培养情况进行观察或需要取出时，将培养基放置架向外拔取，培养基放置架通过连接结构克服密封件与培养仓之间的摩擦力带动移动板向前移动，同时单向出气部件控制培养仓内的气体单向进入至气体浓度调节室内；当移动板移动至最前端位置时，培养基放置架伸出至培养仓外，且移动板始终隔断培养仓内部与外界的连通；上述结构下，当放置架被向外抽出时，为单向出气部件控制培养仓内的气体进入至箱体内，进而放置架抽出过程中即使培养仓与外界是连通状态的，但原先培养仓内的气体还是会优先被输送回箱体内，外界空气也仅会有部分混入，极大程度的减小了培养仓在打开时外界气体进入箱体内的可能，进一步降低箱体内环境稳定性受到的影响；而在观察完毕或操作完毕将放置架推回至培养仓内的过程中，由于箱体内的气体受到挤压而压强增大，进而会有箱体内向培养仓内喷出，将原本存在于培养仓内的外界空气向外挤出，从而当放置架完全插回至培养仓内时，培养仓内留存的外界空气也将很少，从而进一步降低箱体内环境稳定性受到的影响，降低气体浓度调节室对气体浓度调整的耗时，减小箱体内环境受到影响的时间，提升胚胎的成活率。所述单向出气部件包括设于移动板上的两圆形开口、由圆形开口向移动板后端面延伸形成的第一接头及设于第一接头上的单向阀；所述单向进气部件包括设于移动板上的两通孔、由通孔向移动板前端面延伸形成的第二接头及设于第二接头上的单向阀；结构简单，便于实现，加工效率高。所述培养基放置架包括横截面为U型结构的架体、固连于架体一端上的盖板及设于盖板上的拉手；所述连接结构包括设于培养仓进口端上的固定座、设于固定座上供所述架体穿过的方形开口、设于移动板上供架体尾端插入的U型槽、设于架体尾端上的多个间隔均匀分布的U型凸棱、设于U型槽内的供所述凸棱插入的开口槽、固设于架体上的L型插接件、设于插接件尾端上的三角形插接头、设于移动板上供所述插接头插入的插接槽、可左右移动的设于该插接槽内的限位块、设于限位块侧壁与插接槽内壁之间的弹簧及设于限位块上与所述插接头相配合的第一倾斜面和第二倾斜面；所述弹簧的一端与限位块固连，另一端与插接槽的内壁固连；所述第一倾斜面位于限位块的前端面上，第二倾斜面位于限位块的后端面上，且该第一倾斜面的倾斜角度大于第二倾斜面的倾斜角度；上述结构下，当架体插入培养仓内时，架体端部插入至U型槽内，并且推动移动板向后移动，带移动板移动至无法再后移的位置后，架体向后推动的力将驱动架体端部更加深入的插入至U型槽内，进而使得凸棱插入至开口槽内，插接头则顺着第一倾斜面向插接槽内滑动，克服弹簧的弹力将限位块向后顶动，使得插接头插入至插接槽内，之后限位块在弹簧的作用下回弹至原位；进而当架体向外抽出时，凸轮与开口槽、插接头与限位块之间同时避免架体与移动板之间的牢固连接，保证即使移动板上的密封件与培养仓内壁之间因为密封配合而存在较大摩擦力的情况下，架体与移动板也不会直接分离，保证架体始终带动移动板向外移动；且由于第二倾斜面的斜度小于第一倾斜面的斜度，进而在正常拉动下，插接头要沿第二倾斜面滑动并顶动限位块向后移动相较第一倾斜面要困难很多，保证插接头能够快速的插入插接槽内，但不会很容易的直接由插接槽内拔出，但第二倾斜面还是能够保证插接头顶动限位块移动，进而实现插接头同样能够自动向外拔出，无需另外设置结构驱动限位块动作以使得插接头能够向外拔出；设置了固定座，在架体进行插入时，固定座能够对架体起到支撑的作用，而由于插入是架体尾端也已经直接部分插入至U型槽内，进而移动板和固定座将构成对架体的两点支撑，进而架体能够稳定的插入至培养仓内，培养仓内壁上无需设置导轨本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高哺乳动物胚胎体外存活率的培养方法，其特征在于：包括以下步骤：/n（1）从母羊身上取得羊卵母细胞置入成熟培养液内，在培养箱内培养 20-24 小时，获得成熟的羊卵母细胞；/n（2）将成熟的羊卵母细胞与精子一同放入受精培养液中，在培养箱内培养18-24小时，进行受精，获得早期羊胚胎；/n（3）将受精后的羊胚胎用TCM199培养液进行反复冲洗，之后放入羊胚胎体外培养液中，并置入培养箱中进行胚胎体外培养，该培养箱内温度维持在38-39℃，气体浓度维持在5%CO2；/n其中，上述培养箱包括培养室（1）、与该培养室相配合的室门（2）、与该培养室相连通的气体浓度调节室（3）；所述培养室（1）内具有多个培养仓（11），多个培养仓内分别上设有培养基放置架（4）和隔断装置，所述培养基放置架（4）可插入至培养仓（11）内，且插入后培养基放置架（4）与培养仓（11）的进口处密封配合；上述培养步骤过程中需要对培养箱内的不同位置上胚胎进行观察时，操作者可将培养基放置架（4）由独立的培养仓（11）中抽出，并且培养基放置架（4）被抽出的过程中，所述隔断装置将隔断对应培养仓（11）与外界的连通。/n

【技术特征摘要】
1.一种提高哺乳动物胚胎体外存活率的培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）从母羊身上取得羊卵母细胞置入成熟培养液内，在培养箱内培养20-24小时，获得成熟的羊卵母细胞；
（2）将成熟的羊卵母细胞与精子一同放入受精培养液中，在培养箱内培养18-24小时，进行受精，获得早期羊胚胎；
（3）将受精后的羊胚胎用TCM199培养液进行反复冲洗，之后放入羊胚胎体外培养液中，并置入培养箱中进行胚胎体外培养，该培养箱内温度维持在38-39℃，气体浓度维持在5%CO2；
其中，上述培养箱包括培养室（1）、与该培养室相配合的室门（2）、与该培养室相连通的气体浓度调节室（3）；所述培养室（1）内具有多个培养仓（11），多个培养仓内分别上设有培养基放置架（4）和隔断装置，所述培养基放置架（4）可插入至培养仓（11）内，且插入后培养基放置架（4）与培养仓（11）的进口处密封配合；上述培养步骤过程中需要对培养箱内的不同位置上胚胎进行观察时，操作者可将培养基放置架（4）由独立的培养仓（11）中抽出，并且培养基放置架（4）被抽出的过程中，所述隔断装置将隔断对应培养仓（11）与外界的连通。


2.根据权利要求1所述的提高哺乳动物胚胎体外存活率的培养方法，其特征在于：步骤（1）中培养箱内的温度维持在38-39℃，气体浓度维持在5%CO2。


3.根据权利要求1所述的提高哺乳动物胚胎体外存活率的培养方法，其特征在于：上述步骤（2）中的受精培养液为含3%羊血清的TCM199培养液。


4.根据权利要求1所述的提高哺乳动物胚胎体外存活率的培养方法，其特征在于：所述隔断装置包括可前后动作的设于培养仓内的移动板（51）、设于移动板外侧壁上与培养仓内壁密封配合的一圈密封件（52）、设于移动板上的单向出气部件和单向进气部件、导通部件及用于实现培养基放置架和移动板之间的连接配合的连接结构；当培养基放置架（4）插入至培养仓（11）内时，培养基放置架（4）抵触移动板（51）向后移动，同时单向进气部件控制气体浓度调节室内的气体单向进入至培养仓内；当移动板（51）移动至最后端位置时，连接结构实现培养基放置架（4）和移动板（51）之间的连接配合，同时导通部件实现培养仓（11）与气体浓度调节室（3）的直接连通；当需要对培养仓（11）内的培养培养情况进行观察或需要取出时，将培养基放置架（4）向外拔取，培养基放置架（4）通过连接结构克服密封件（52）与培养仓（11）之间的摩擦力带动移动板（51）向前移动，同时单向出气部件控制培养仓（11）内的气体单向进入至气体浓度调节室（3）内；当移动板（51）移动至最前端位置时，培养基放置架（4）伸出至培养仓（11）外，且移动板（51）始终隔断培养仓（11）内部与外界的连通。


5.根据权利要求4所述的提高哺乳动物胚胎体外存活率的培养方法，其特征在于：所述单向出气部件包...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱寒峰，吴婷，徐雅萍，董信阳，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33