由胎盘间充质干细胞简易制备细胞因子的方法技术

本发明专利技术涉及由胎盘间充质干细胞简易制备细胞因子的方法。一方面，涉及从胎盘间充质干细胞中分离提取外泌体和细胞因子的方法，包括如下步骤：培养胎盘间充质干细胞获得培养上清；将培养上清经葡聚糖凝胶柱层析得到层析液；使用切向流超滤系统对层析液进行浓缩，得到外泌体浓缩液，同时得到的超滤过滤液再次使用切向流超滤系统对层析液进行浓缩进行过滤浓缩细胞因子浓缩液；将外泌体浓缩液或细胞因子浓缩液冷冻保存或者冷冻干燥。还涉及制备细胞因子浓缩液的方法。本发明专利技术方法呈现如说明书所述优异性质。

A simple method for the preparation of cytokines from placental mesenchymal stem cells

The invention relates to a simple method for preparing cytokines from placenta mesenchymal stem cells. On the one hand, it involves separation and extraction of exocrine and cytokines from placental mesenchymal stem cells, including the following steps: culture of placenta derived mesenchymal stem cells to obtain the culture supernatant; the culture supernatant is obtained through Sephadex gel column chromatography to obtain the chromatographic solution; the tangential flow ultrafiltration system is used to concentrate the chromatography solution to obtain the exocrine concentrate, and the ultrafiltration filtrate obtained at the same time is again made. The chromatography solution was concentrated by the tangential flow ultrafiltration system, and then the cytokine concentrate was filtered and concentrated; the exosomes concentrate or cytokine concentrate was cryopreserved or freeze-dried. The invention also relates to a method for preparing a cytokine concentrate. The method of the invention has excellent properties as described in the specification.

【技术实现步骤摘要】
由胎盘间充质干细胞简易制备细胞因子的方法
本专利技术属于生物
，涉及一种获取参与细胞生物活动的膜泡的方法，尤其涉及一种由人胎盘间充质干细胞(MSC)分离并获取外泌体(Exosome，或记作Exosomes)的方法，以及其在细胞修复中的应用。特别地，本专利技术涉及人胎盘间充质干细胞源分离外泌体的方法。此外，本专利技术还涉及通过简易制备胎盘间充质干细胞的细胞因子的方法。
技术介绍
间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)是来源于中胚层的一类非造血系统多能干细胞，现已证实MSCs除具有自我更新和多向分化潜能外，还具有很强的抗炎和抑制多种免疫细胞的能力，并能够诱导外周免疫耐受。研究表明MSCs通过分泌多种免疫调节因子，如IFN-γ、PGE2等(可参见：PolchertD,SobinskyJ,DouglasG,KiddM,MoadsiriA,ReinaE,etal.IFN-gammaactivationofmesenchymalstemcellsfortreatmentandpreventionofgraftversushostdisease.Europeanjournalofimmunology.2008；38(6):1745-55.以及SpaggiariGM,AbdelrazikH,BecchettiF,MorettaL.MSCsinhibitmonocyte-derivedDCmaturationandfunctionbyselectivelyinterferingwiththegenerationofimmatureDCs:centralroleofMSC-derivedprostaglandinE2.Blood.2009；113(26):6576-83.)，从而抑制免疫细胞(如T细胞、B细胞、NK细胞、抗原呈递细胞等)的功能(可参见：CorcioneA,BenvenutoF,FerrettiE,GiuntiD,CappielloV,CazzantiF,etal.HumanmesenchymalstemcellsmodulateB-cellfunctions.Blood.2006；107(1):367-72.以及DiNicolaM,CarloStellaC,MagniM,MilanesiM,LongoniPD,MatteucciP,etal.HumanbonemarrowstromalcellssuppressT-lymphocyteproliferationinducedbycellularornonspecificmitogenicstimuli.Blood.2002；99(10):3838-43.)。近年来，随着对间充质干细胞研究的不断深入，其分泌因子已成为研究者们的热点。间充质干细胞可以分泌多种具有生物活性的细胞因子，这些细胞因子可有效地调控机体细胞信号传导、活化人体干细胞，进而生理性修复或替代机体损伤、病变及衰老的细胞。干细胞在美容中的应用，最早是干细胞在整形外科中的运用，它是目前研究较多的一种干细胞美容技术。而在整形外科中应用得较多的干细胞种类主要亦是人脐带间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞等。传统上所谓的干细胞美容术，一般都是直接注射干细胞针剂。而这种注射用干细胞的来源主要是从流产的胚胎中提取的，所以难免会引起免疫排斥反应，而且存在一定的论理问题。即使是采用自体干细胞，如人脂肪间充质干细胞，但是在干细胞的培养扩增过程中亦难免会引入外源性的蛋白(例如胎牛血清)，容易引起免疫排斥反应。所以，科学家们最近提出一种新的干细胞应用方法，即细胞培养上清活性因子及细胞裂解液的应用。将细胞活性因子添加到美容化妆品，不仅具有一般化妆品的保湿美白功效，还能够修复受损皮肤，消除皮肤皱纹，收缩毛孔，改善面色等，越来越受到人们的关注。含细胞活性因子的化妆品现已在多个国家上市，尤其是在以美容整形行业最为发达的韩国，细胞因子化妆品尤为甚行。我国亦有多家规模较大的干细胞公司开发出了细胞因子化妆品。但市面上的细胞因子化妆品一般采用干细胞培养上清液直接掺入或经冻干后掺入化妆品基质的方式制造，细胞因子含量较低，且含有大量糖分等其它杂质，使用这些化妆品后反而会造成皮肤干燥等不适感。研究表明细胞培养上清液含有各种具有生物活性的细胞因子，它的应用可以避免干细胞美容时的产生的免疫排斥反应。但是，液态的培养上清在常温保存时间短，这就阻碍了它的推广和应用。另外，针对目前的干细胞分选技术，比较常见是的磁珠分选，但常规的分选中，磁珠会随同干细胞一同进行后续的培养，即磁珠并没有从干细胞上脱离下来，这样对于干细胞的后期生产，必定会产生一定的影响，虽然有一些方法，如加入一些细菌或者其他物质进行降解，但这样也相当于加入了其他的外源蛋白质等成分，造成对干细胞的二次污染，所以实际上并没有解决上述问题。间充质干细胞在培养过程中会分泌大量的细胞因子，这些细胞因子能够深入肌肤基底，促进肌肤细胞组织的分化；促进受损肌肤组织的结构重建以及再生修复，促进老化细胞的脱落以及细胞的新生等；修复皮肤纤维组织，促进皮下胶原蛋白的分泌与合成，还可以促进皮下血管新生成，分泌蛋白质，促进受损肌肤深层细胞组织愈合，淡化疤痕和痘印等。目前有一些对干细胞培养上清液进行提取纯化的报道，但效果依然不佳，例如公告号为CN102600057B的专利公开了一种人胎盘干细胞提取物冻干粉的制备方法，对得到的细胞培养液采用单一的3000D滤膜进行超滤截留，其去掉了部分杂质，但是糖类等杂质仍未除掉，并且还导致细胞因子大量损失，修复效果不佳，而且同样也会造成皮肤干燥等不适感，实际应用价值较低。外泌体(exosome)是一种由细胞分泌的直径约30～100nm，密度范围在1.13～1.19g/ml之间的膜性微囊泡。外泌体可携带多种与源细胞相似的蛋白质、mRNA、miRNA，参与免疫调节、细胞通讯、细胞迁移、血管新生等过程(可参见：Yanez-MoM,SiljanderPR,AndreuZ,ZavecAB,BorrasFE,BuzasEI,etal.Biologicalpropertiesofextracellularvesiclesandtheirphysiologicalfunctions.Journalofextracellularvesicles.2015；4:27066.)。Lai等发现MSCs来源的外泌体可减少心肌缺血再灌注损伤，并且证实外泌体的miRNA可以促进血管新生，因此外泌体可能成为治疗心血管疾病的一个新方向(可参见：LaiRC,ArslanF,LeeMM,SzeNS,ChooA,ChenTS,etal.ExosomesecretedbyMSCreducesmyocardialischemia/reperfusioninjury.Stemcellresearch.2010；4(3):214-22.)。Xin等发现MSCs来源的外泌体通过转移miR-133b到神经细胞，可促进神经轴突的生长(可参见：XinH,LiY,BullerB,KatakowskiM,本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.从胎盘间充质干细胞中分离提取外泌体和细胞因子的方法，该方法包括如下步骤：/n1)提供处于对数生长期的第2～5代人胎盘间充质干细胞，以5000～15000/cm

【技术特征摘要】
1.从胎盘间充质干细胞中分离提取外泌体和细胞因子的方法，该方法包括如下步骤：
1)提供处于对数生长期的第2～5代人胎盘间充质干细胞，以5000～15000/cm2的密度接种至包含2mM的L-谷氨酰胺的DMEM/F12培养基中培养，培养3-4天后，收集上清，以20000g离心力离心20min除去细胞以及碎片，再经0.22μm滤膜过滤，得到培养上清；
2)将Pudex葡聚糖凝胶过滤介质PudexG-25用玻璃棒引流导入层析柱中，边装边用玻璃棒搅拌；
3)装好柱后，用移液枪将柱子中上面的水吸出，再将步骤1)收集的培养上清加载到层析柱中；
4)盖上层析柱的上盖，将上盖的细管插入到盛有双蒸水的烧杯中，打开恒流泵和收集器装置，调节恒流泵的速度和收集器时间，开始洗脱并收集包含细胞分泌物的洗脱馏份，作为层析液；
5a)使用切向流超滤系统(例如仕必纯KR2i型切向流超滤系统)对层析液进行浓缩，用超纯水冲洗管路，安装100kD100cm2的MidiKros过滤器，对步骤4)所得层析液5L进行过滤浓缩，得到100ml浓缩50倍的回流液为外泌体浓缩液，同时得到超滤过滤液；
5b)重新安装1kD100cm2的MidiKros过滤器，对步骤5a)所得超滤过滤液进行过滤浓缩，得到100ml浓缩50倍的回流液为细胞因子浓缩液；任选的6)将外泌体浓缩液分装，在-80℃条件冷冻保存；或者向外泌体浓缩液中添加冻干赋形剂后冷冻干燥；另外，将细胞因子浓缩液分装，在-80℃条件冷冻保存；或者向细胞因子浓缩液中添加冻干赋形剂后冷冻干燥。


2.根据权利要求1的方法，其中：
步骤1)中，以10000/cm2的密度接种细胞；和/或
步骤1)中，还包括向经0.22μm滤膜过滤所得滤液中添加甘露糖磷酸酯钠使溶解，作为培养上清；在一个实施方案中，甘露糖磷酸酯钠添加的质量/体积百分浓度为0.05～0.1％，例如0.08％。


3.根据权利要求1的方法，步骤1)中，处于对数生长期的第2～5代人胎盘间充质干细胞是照包括如下步骤的方法得到的：
(1)处理胎盘组织
将人胎盘去除羊膜，剪取胎盘小叶表层膜样组织，用生理盐水清洗；
将胎盘小叶表层膜样组织剪碎至体积大小约0.2cm3的组织碎块；
将组织碎块置离心管中，加入0.9％生理盐水适量，使用300目滤网过滤，并使用0.9％生理盐水适量再清洗两次，至滤液清澈；
将清洗后的组织加入含有0.005％的LiberaseMNP-S酶和0.05％的DNAI型酶的HBSS消化液中，充分混匀后，于摇床中振荡消化30min(37℃，100rpm)；
(2)获得胎盘原始细胞
消化结束后，在离心管中加入胎牛血清终止消化，混匀后使用含有5％右旋糖酐、2.5％人血清白蛋白、200U的DNaseI的生理盐水50ml稀释，使用300目滤网过滤，再用100ml生理盐水多次洗涤组织，收集滤液；
使所得滤液以1400rpm离心5min(例如，加速度9、减速度7)，去上清收集沉淀，用生理盐水重悬后再次离心，收集沉淀；
用DMEM/F12重悬沉淀细胞，取样计数，得P0代细胞；
(3)纯化培养
培养条件：含10％胎牛血清、2mML-谷氨酰胺的DMEM/F12培养基，于37℃、5％CO2的恒温湿培养箱中培养；
消化条件：0.25％的胰酶，37℃消化2分钟；
收获条件：用完全培养基(即10％胎牛血清、2mML-谷氨酰胺的DMEM/F12培养基)终止消化后1400rpm离心5分钟，收集沉淀；
以5000～15000/cm2的接种密度将胎盘P0代细胞接种于T75培养瓶中，第3-4天全换液；第6-7天有若干细胞克隆出现，第10-11天有成片的梭形呈旋涡状生长的细胞，即P1代胎盘间充质干细胞，收集后可进行传代；
以5000～15000/cm2的接种密度培养，与P0-P1相同的培养基成分和培养条件，3-4天后收获，得P2代细胞；以此类推，以同样接种密度、相同培养条件培养3-4天后收获，得P3、P4、P5代胎盘间充质干细胞；和任选的
(4)对所得胎盘间充质干细胞进行检测。


4.根据权利要求1的方法，其中：
步骤2)中，层析柱是葡聚糖凝胶G-25柱；
步骤4)中，还包括向所得洗脱馏份中添加氯化镁使溶解，作为层析液；在一个实施方案中，氯化镁添加量占洗脱馏份的质量/体积百分浓度为0.02～0.05％，例如0.04％。


5.根据权利要求1的方法，步骤6)中，对外泌体浓缩液或者细胞因子浓缩液进行冷冻干燥是照如下方式进行的：
7.1)取外泌体浓缩液或者细胞因子浓缩液，或者取-80℃冷冻的外泌体浓缩液或者细胞因子浓缩液于37℃水浴使完全融化，加入5～15％冻干赋形剂，使赋形剂溶解；
7.2)加入赋形剂后的溶液用70μm滤器过滤，随后分装入玻璃瓶中，每瓶2～5ml，盖好分叉胶塞，置冷冻干燥机中，开启如下冻干程序：
在常压下预冷冻3.5小时，温度为-30～-40℃；
开启真空泵，使真空度值为0.04mbar，在-38～-40℃温度下冷冻1～3小时；
维持真空度不变，升温至-20～-25℃温度下冷冻干燥10～15小时；
维持真空度不变，升温至-2～2℃温度下冷冻干燥1～3小时；
维持真空度不变，升温至33～37℃温...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘冰，肖海蓉，李诣书，
申请(专利权)人：博雅干细胞科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32