一种小鼠卵母细胞的体外受精方法技术

本发明专利技术涉及一种小鼠卵母细胞的体外受精方法，包括体外成熟卵母细胞的制备；精子获能；精卵孵育和胚胎早期培养等步骤。通过本发明专利技术研究卵母细胞体外成熟时间、颗粒细胞有无、精子获能时间、精子密度、精卵孵育时间等条件对体外受精的影响，摸索出精子获能时间60min、精子密度3×10

In vitro fertilization of mouse oocytes

The invention relates to a method for in vitro fertilization of mouse oocytes, which comprises the steps of preparation of in vitro mature oocytes, sperm capacitation, sperm egg incubation, early embryo culture, etc. The invention studies the influence of the conditions such as the in vitro maturation time of oocyte, the presence or absence of granular cells, the time of sperm capacitation, sperm density, the time of sperm egg incubation on in vitro fertilization, and finds out the sperm capacitation time of 60min and sperm density of 3 \u00d7 10

【技术实现步骤摘要】
一种小鼠卵母细胞的体外受精方法
本专利技术涉及一种用于小鼠卵母细胞的体外受精方法，属于生物

技术介绍
体外受精是指哺乳动物的精子和卵子在体外人为控制环境中完成受精过程的技术。这项技术于20世纪50年代取得成功，体外受精技术对于一些濒危动物和优良家畜品种的后代续繁、性别控制、品种资源保存有重大意义，其最大优点是能够打破时间和空间限制。鉴于此，科研人员模拟卵母细胞在体内受精和胚胎发育的情况，从而获得高的受精率和胚胎发育率，提高体外受精的效果。在不同添加剂对卵母细胞体外受精的影响方面，有学者提出BSA(牛血清白蛋白)具有降低小鼠体外受精率的作用，认为卵母细胞透明带在含有BSA的体系中发生硬化。郭勇、夏国良等研究结果证明，人的重组促黄体生成素(r-hLH)对小鼠卵母细胞的体外受精有明显的促进作用，同时对相应胚胎进一步发育产生明显的抑制作用。朱佳伟等研究结果显示半胱氨酸和胱氨酸通过促进小鼠体外成熟卵母细胞合成GSH的方法提高受精率，这种提高与浓度有很大关系，并且只有在200μM才能显著提高，更高浓度具有相反的效果。在体外受精的相关研究中，由于实验方法和培养液等条件不同，对体外受精的结果影响较大。如何从卵母细胞体外成熟时间、精子获能时间、精子密度、精卵孵育时间等条件中，探索和优化小鼠卵母细胞体外受精及早期胚胎发育的适宜环境，是本领域的技术人员进行科学研究需要解决的技术问题。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术目的是提供一种用于小鼠卵母细胞的体外受精方法。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种小鼠卵母细胞的体外受精方法，包括以下步骤：(1)体外成熟卵母细胞的制备(1.1)液滴制备在超净工作台中用M2培养基制备液滴，然后移入37℃、5％的CO2的细胞培养箱中平衡过夜，备用；(1.2)小鼠处理选取健康未孕、体重22～25g的雌性小鼠，腹腔注射法注入孕马血清促性腺激素PMSG，每只小鼠注射0.1mL，48h后用颈部脱臼法将小鼠处死；(1.3)卵母细胞的采集与体外培养将处死后的小鼠在75％(v/v)的酒精中浸泡0.5～1分钟，用镊子取出并轻轻刮下小鼠毛皮上的酒精，然后剪开腹腔并摘取卵巢，将卵巢放入PBS缓冲液中洗去血液和脂滴，再放入提前准备好的的体外操作液中，整个操作在37℃恒温板上进行；用注射器刺破卵巢表面的卵泡，释放出卵母细胞；在显微镜下用吸卵针挑选出形状规则、胞质均匀、颜色正常的GV期卵母细胞，包括带有颗粒细胞的卵母细胞和裸卵，并将其在M2培养基中洗2～3次，再放入备用的液滴中洗涤2次，最后放入37℃、5％的CO2细胞培养箱中培养14h，观察卵母细胞的体外成熟情况；(2)精子获能(2.1)精子获能液的平衡精子获能液HTF提前12h放入37℃、5％的CO2细胞培养箱中平衡，备用；(2.2)小鼠精液的采集、离心和获能选取8～10周龄健康的昆明系雄性小鼠，将小鼠颈部脱臼法处死，放入75％(v/v)的酒精中消毒1-2min，将小鼠四肢朝上放入备好的套有干净袋子的托盘中；一只手持有高压消毒过的洁净镊子轻轻夹起小鼠腹部皮肤，另一只手拿剪刀在小鼠后腹中部剪开一小口，沿左右两后肢的方向向前剪开，切口呈V字形，将皮肤拉开后拨开脂肪，沿附睾和输精管将脂肪剪下，将睾丸下端的脂肪和输精管剪断，使睾丸、附睾和输精管一起剪下，放入提前备好的PBS缓冲液中清洗，洗去脂滴和血液，使附睾、输精管与睾丸分离，将附睾和输精管放入提前平衡好的精子获能液中，将附睾和输精管撕碎，放入二氧化碳细胞培养箱中孵育10min，使精子游出；精子游出后，将精子获能液中的碎组织取出，将精子获能液在2000r/min下离心3min；弃去上清液，在离心管中加入平衡好的200μL精子获能液并加入精子；将离心管放入37℃、5％的CO2细胞培养箱中获能，获能时间为40-80min；其中的精液采集、离心和获能均在37℃恒温板上进行；(2.3)精子密度取10μL获能后的精液，加入到40μL3％的氯化钠溶液中，氯化钠溶液需要在37℃恒温板上预热，用血细胞计数板测定精子密度；精子密度为3×105-3×107个/mL；(2.4)精子活力取一滴获能后的精液滴在预热的载玻片上，观察并计算精子活力，整个操作过程在37℃恒温板上进行；要求精子活力在0.7以上，备用；(3)精卵孵育(3.1)体外受精液的准备将体外受精液TYH提前12h放入37℃、5％的CO2细胞培养箱中平衡，备用；(3.2)精卵共孵育将获能后的精子离心，2000r/min转速下离心3min；离心完成后弃去上清液，在沉淀物中加入提前平衡好的体外受精液，混合均匀后调整精子密度；将体外成熟的卵母细胞在体外受精液中洗涤2-3次，移至平衡后的体外受精液中，整个操作过程均在37℃恒温板上进行；然后放入37℃、5％CO2的细胞培养箱中进行精卵孵育，精卵孵育时间为2-8h；(4)胚胎早期培养(4.1)胚胎培养液准备胚胎培养液KSOM提前12h放入37℃、5％的CO2细胞培养箱中平衡，备用；(4.2)早期胚胎培养卵母细胞和精子在体外受精液中培养2-8h后，将受精的卵母细胞从受精液中移出，在平衡过的胚胎培养液中洗2-3次，然后在37℃恒温板上预热；将洗过的受精卵移入平衡过的胚胎培养液中，培养24h后观察受精卵卵裂情况，并计算卵裂率。所述的卵母细胞分为带颗粒的细胞卵母细胞COCs和不带颗粒的细胞卵母细胞NO两组。所述带颗粒的细胞卵母细胞COCs组的获能时间为80min；不带颗粒的细胞卵母细胞NO组的获能时间为60min。所述带颗粒的细胞卵母细胞COCs组的精卵孵育时间为2h；不带颗粒的细胞卵母细胞NO组的精卵孵育时间为6h；所述精子密度为3×106个/mL。本专利技术有益效果：1、本专利技术研究卵母细胞体外成熟时间、颗粒细胞有无、精子获能时间、精子密度、精卵孵育时间等条件对体外受精的影响，从而优化出小鼠卵母细胞体外受精及早期胚胎发育环境。2、本专利技术优化了两种形态的卵母细胞，即带颗粒细胞卵母细胞COCs和不带颗粒细胞卵母细胞NO的体外受精条件，在卵母细胞体外受精过程中，获能后的精子与体外培养成熟的卵母细胞进行精卵孵育，带颗粒细胞卵母细胞COCs体外受精过程中精卵孵育2h实验组的卵裂率最高，达到36.09％；不带颗粒细胞卵母细胞NO体外受精过程中，精卵孵育6h实验组的卵裂率最高，达到55.99％。3、本专利技术研究小鼠在体外受精过程中，摸索出在精子获能时间60min、精子密度3×106个/mL、精卵孵育时间6h时卵母细胞卵裂率最高的结论，优化了小鼠卵母细胞体外受精及早期胚胎发育的最适环境，为进一步科学研究打下基础。具体实施方式以下结合实施例对本专利技术的具体实施方式作进一步详细说明。实验动物：昆明系小白鼠，SPF等级，22～25g雌鼠，8本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种小鼠卵母细胞的体外受精方法，其特征是，该方法包括以下步骤：/n(1)体外成熟卵母细胞的制备/n(1.1)液滴制备/n在超净工作台中用M2培养基制成液滴，然后移入37℃、5％的CO

【技术特征摘要】
1.一种小鼠卵母细胞的体外受精方法，其特征是，该方法包括以下步骤：
(1)体外成熟卵母细胞的制备
(1.1)液滴制备
在超净工作台中用M2培养基制成液滴，然后移入37℃、5％的CO2的细胞培养箱中平衡过夜，备用；
(1.2)小鼠处理
选取健康未孕、体重22～25g的雌性小鼠，腹腔注射法注入孕马血清促性腺激素PMSG，每只小鼠注射0.1mL，48h后用颈部脱臼法将小鼠处死；
(1.3)卵母细胞的采集与体外培养
将处死后的小鼠在75％(v/v)的酒精中浸泡0.5～1分钟，用镊子取出并轻轻刮下小鼠毛皮上的酒精，然后剪开腹腔并摘取卵巢，将卵巢放入PBS缓冲液中洗去血液和脂滴，再放入提前准备好的的体外操作液中，整个操作在37℃恒温板上进行；用注射器刺破卵巢表面的卵泡，释放出卵母细胞；在显微镜下用吸卵针挑选出形状规则、胞质均匀、颜色正常的GV期卵母细胞，包括带有颗粒细胞的卵母细胞和裸卵，并将其在M2培养基中洗2～3次，再放入备用的液滴中洗涤2次，最后放入37℃、5％的CO2细胞培养箱中培养14h，观察卵母细胞的体外成熟情况；
(2)精子获能
(2.1)精子获能液的平衡
精子获能液HTF提前12h放入37℃、5％的CO2细胞培养箱中平衡，备用；
(2.2)小鼠精液采集、离心和获能
选取8～10周龄健康的昆明系雄性小鼠，将小鼠颈部脱臼法处死，放入75％(v/v)的酒精中消毒1-2min，将小鼠四肢朝上放入备好的套有干净袋子的托盘中；
一只手持有高压消毒过的洁净镊子轻轻夹起小鼠腹部皮肤，另一只手拿剪刀在小鼠后腹中部剪开一小口，沿左右两后肢的方向向前剪开，切口呈V字形，将皮肤拉开后拨开脂肪，沿附睾和输精管将脂肪剪下，将睾丸下端的脂肪和输精管剪断，使睾丸、附睾和输精管一起剪下，放入提前备好的PBS缓冲液中清洗，洗去脂滴和血液，使附睾、输精管与睾丸分离，将附睾和输精管放入提前平衡好的精子获能液中，将附睾和输精管撕碎，放入二氧化碳细胞培养箱中孵育10min，使精子游出；
精子游出后，将精子获能液中的碎组织取出，将精子获能液在2000r/min下离心3min；弃去上清液，在离心管中加入平衡好的200μL精子获能液并加入精子；将离心管放入37℃、5％的CO2细胞培养箱中获能，获能时间为40-80min；其中的精...

【专利技术属性】
技术研发人员：张景锋，靖娜娜，郝京京，张长兴，朱宽佑，徐秋良，牛晖，李婉涛，
申请(专利权)人：河南牧业经济学院，
类型：发明
国别省市：河南;41