一种一步式胚胎培养液制造技术

本发明专利技术公开了一种一步式胚胎培养液，本发明专利技术中一步式胚胎培养液，包含对胚胎培养和发育起着重要作用的物质：(±)‑α‑硫辛酸、乙酰L‑肉碱或乙酰L‑肉碱盐酸盐以及胰岛素、转铁蛋白、硒、Fetuin‑A、血小板源生长因子PDGF(Platelet derived growth factor，PDGF)。利用该组物质制备的一步式胚胎培养液既保留了胚胎培养发育过程中分泌入培养液中的有利成分，起到保护促进细胞生长发育并抑制细胞分解利用有害产物的作用，又避免了胚胎在移植过程中可能受到的机械损伤和培养环境变化造成的应激反应而导致的囊胚形成率不高的问题。

One step embryo culture medium

The invention discloses a one-step embryo culture medium, in which the one-step embryo culture medium includes substances that play an important role in embryo culture and development: (\u00b1) - \u03b1 - lipoic acid, acetyl L-carnitine or acetyl L-carnitine hydrochloride, insulin, transferrin, selenium, fetuin A and platelet-derived growth factor (PDGF). The one-step embryo culture medium prepared with this group of substances not only retains the favorable components secreted into the culture medium during the development of embryo culture, but also protects and promotes the growth and development of cells and inhibits the decomposition and utilization of harmful products, and avoids the blastocyst formation rate caused by the mechanical damage that can be suffered by embryos during the transfer process and the stress response caused by the change of culture environment Not high.

【技术实现步骤摘要】
一种一步式胚胎培养液
本专利技术属于胚胎细胞培养领域，具体涉及一种一步式胚胎培养液。
技术介绍
IVF，invitrofertilization(体外受精)：又称试管婴儿，是指分别将卵子与精子取出后，置于试管内使其受精，再将胚胎前体——受精卵移植回母体子宫内发育成胎儿。IVF培养通常分为两种流程即两种培养液系列：全程(单/一步式培养液系列)和分程(双培养液系列)。利用双培养液系列流程对胚胎早期和后期阶段提供不同的培养液成份，但也丢失了由胚胎分泌入培养液中的重要的有效成份，如胚胎营养因子。全程培养液系列流程保留了这些重要的有效成份，但也保留了培养液中有害的分解产物。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术的目的在于提供一种用于体外胚胎培养发育的一步式胚胎培养液制备所需的重要物质。本专利技术的一步式胚胎培养液保留了胚胎分泌入培养液中的有效成分，能起到保护细胞促进胚胎高效率生长发育并抑制细胞分解利用有害产物的作用。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为：用于制备一步式胚胎培养液的重要组合物，所述组合物由(±)-α-硫辛酸、乙酰L-肉碱或乙酰L-肉碱盐酸盐以及胰岛素、转铁蛋白、硒、Fetuin-A、血小板源生长因子PDGF(Plateletderivedgrowthfactor，PDGF)组成。关键物料为血清替代物，由胰岛素、转铁蛋白、硒、Fetuin-A、人血小板源生长因子PDGF组成：胰岛素是由胰脏内的胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素，能够促进细胞对培养液中葡萄糖的代谢利用，促进细胞中的脂肪、蛋白质合成，促进外周培养液中K+、Mg2+穿过细胞膜进入细胞内，促进脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)及三磷酸腺苷(ATP)的合成，对胚胎细胞体外发育具有重要的促进作用。转铁蛋白是血浆中主要的铁传递蛋白，负责运载由消化管吸收的铁和由红细胞降解释放的铁，为细胞内化和细胞代谢提供所需的铁。所有的细胞生长都离不开转铁蛋白。不但维持正常的细胞代谢依赖于以生物活性形态存在的铁，铁还是一些酶的辅助因子，比如RNA聚合酶，DNA合成酶，同时也是血红蛋白的重要组成部分。硒是动物和人体中一些抗氧化酶(谷胱甘肽过氧化物酶)和硒-P蛋白的重要组成部分，在体内起着平衡氧化还原氛围、提高人体免疫力的作用。硒在人体组织内含量为千万分之一，但它却决定了生命的存在，其对人类健康的巨大作用是其他物质无法替代的，缺硒会直接导致人体免疫能力下降，已被作为人体必需的微量元素。Fetuin-A是一种由肝脏合成的59kD的糖蛋白，属于cystatin蛋白超家族(半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族)中的一员，也是血清中最主要的蛋白之一，具有多种生物学功能，包括骨骼形成、胎儿大脑及组织发育、体外促进细胞增殖等。PDGF是一种重要的促有丝分裂因子，具有刺激特定细胞群分裂增殖的能力。所述(±)-α-硫辛酸、乙酰L-肉碱或乙酰L-肉碱盐酸盐、胰岛素、转铁蛋白、硒、Fetuin-A、血小板源生长因子PDGF的摩尔质量比为550.0-980.0：440.0-780.0：0.0138-0.0197：0.0006-0.0008：0.0003-0.0005：0.0002-0.0004：0.0000002-0.0000005。本专利技术的目的之二在于提供一种一步式胚胎培养液，由对胚胎培养和发育起着重要作用的组合物和基本培养液组成，组合物与基本培养液的重量比为0.1％-1％。优选的，所述基本培养液包括无机盐缓冲液、氨基酸、乙二胺四乙酸、丙酮酸钠、丙氨酰谷氨酰胺、牛磺酸、葡萄糖、D-山梨醇、人血清白蛋白和杀菌剂。优选的，所述无机盐缓冲液、氨基酸、乙二胺四乙酸、丙酮酸钠、丙氨酰谷氨酰胺、牛磺酸、葡萄糖、D-山梨醇、N-乙酰-L-半胱氨酸、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸/4-羟乙基哌嗪乙磺酸、3-(N-吗啉基)丙磺酸钠盐的摩尔比为98.303-120.12：1.2-3.8：0.009-0.012：9.459-11.561：24.741-30.239：0.432-0.528：0.9-1.1：0.207-0.254：0.702-0.858:8.125-10.239:8.125-10.239。。所述无机盐缓冲液包括氯化钠、氯化钾、硫酸镁、氯化钙、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾和碳酸氢钠组成的溶液；氯化钠、氯化钾、硫酸镁、氯化钙、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾和碳酸氢钠的摩尔比为89.937-109.923:5-6.083:0.9-1.1:1.62-1.98:0.135-0.165:0.135-0.165:0.576-0.704。优选的，所述人血清白蛋白的含量为0.45-0.55g/L，杀菌剂的含量为5.0-20.0mg/L。优选的，所述杀菌剂为庆大霉素。本专利技术的目的之三在于提供一种一步式胚胎培养液的制备方法，包括以下步骤：1)在百级条件下配制，按上述比例依次将氯化钠、氯化钾、硫酸镁、氯化钙、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、碳酸氢钠、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸/4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES、3-(N-吗啉基)丙磺酸钠盐MOPS-Na、乙二胺四乙酸、丙酮酸钠、丙氨酰谷氨酰胺、牛磺酸、葡萄糖、D-山梨醇、(±)-α-硫辛酸、乙酰L-肉碱或乙酰L-肉碱盐酸盐、氨基酸加到超纯水中，混合后得溶液I；所述氨基酸包括a.必需氨基酸:L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-蛋氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸中的一种或者几种或者其盐的形式；b.非必需氨基酸包含:甘氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-酪氨酸、L-半胱氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸中的一种或者几种或者其盐的形式。2)在溶液I中冲CO2保护气；3)在冲CO2保护气后加入人血白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、硒、Fetuin-A、血小板源生长因子PDGF，混合后得溶液Ⅱ；4)将步骤3)配置好的溶液Ⅱ用0.2um的滤膜过滤除菌后在CO2培养箱中平衡5-10小时；5)将步骤4)平衡好的溶液Ⅱ在CO2保护气无菌分装，得一步式胚胎培养液。优选的，步骤2)中冲的为体积百分数为6-7％的CO2；步骤5)中CO2保护气为体积百分数为6-7％的CO2。优选的，步骤4)中培养箱中平衡的条件为：37℃、6％的CO2培养箱中平衡5-10小时，调节PH在7.20-7.40。本专利技术的有益效果：1)本专利技术提供的一步式胚胎培养液保留了胚胎分泌入培养液中的有效成分，能起到保护细胞并抑制分解利用有害产物的作用，避免胚胎移植过程中可能受到的机械损伤和培养环境不同造成的应激反应而导致的囊胚形成率不高的问题。本专利技术的一步式胚胎培养液培养的胚胎囊胚形成率可以高达95％；2)本专利技术提供的一步式胚胎培养液添加了血清替代物：胰岛素、转铁蛋白、硒、Fetuin-A、人血小板源生长因子PDGF，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种一步式胚胎培养液，其特征在于，包含：/na、对胚胎培养和发育起着重要作用的组合物/nb、基本培养液/n所述组合物，包括(±)-α-硫辛酸、乙酰L-肉碱或乙酰L-肉碱盐酸盐、胰岛素、转铁蛋白、硒、Fetuin-A、血小板源生长因子PDGF。/n

【技术特征摘要】
1.一种一步式胚胎培养液，其特征在于，包含：
a、对胚胎培养和发育起着重要作用的组合物
b、基本培养液
所述组合物，包括(±)-α-硫辛酸、乙酰L-肉碱或乙酰L-肉碱盐酸盐、胰岛素、转铁蛋白、硒、Fetuin-A、血小板源生长因子PDGF。


2.根据权利要求1所述的一步式胚胎培养液，其特征在于，所述组合物与基本培养液的体积比为0.1％-1％。


3.根据权利要求1所述的一步式胚胎培养液，其特征在于，所述组合物中(±)-α-硫辛酸、乙酰L-肉碱或乙酰L-肉碱盐酸盐、胰岛素、转铁蛋白、硒、Fetuin-A、血小板源生长因子PDGF的摩尔质量比为550.0-980.0：440.0-780.0：0.0138-0.0197：0.0006-0.0008：0.0003-0.0005：0.0002-0.0004：0.0000002-0.0000005。


4.根据权利要求1所述的一步式胚胎培养液，其特征在于，所述基本培养液包括无机盐缓冲液、氨基酸、乙二胺四乙酸、丙酮酸钠、丙氨酰谷氨酰胺、牛磺酸、葡萄糖、D-山梨醇、N-乙酰-L-半胱氨酸、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸/4-羟乙基哌嗪乙磺酸、3-(N-吗啉基)丙磺酸钠盐、人血清白蛋白和杀菌剂。


5.根据权利要求4所述的一步式胚胎培养液，其特征在于，所述无机盐缓冲液、氨基酸、乙二胺四乙酸、丙酮酸钠、丙氨酰谷氨酰胺、牛磺酸、葡萄糖、D-山梨醇、N-乙酰-L-半胱氨酸、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸/4-羟乙基哌嗪乙磺酸、3-(N-吗啉基)丙磺酸钠盐的摩尔比为98.303-120.12：1.2-3.8：0.009-0.012：9.459-11.561：24.741-30.239：0.432-0.528：0...

【专利技术属性】
技术研发人员：余裕炉，叶林，刘洪君，严飞，戴甄，
申请(专利权)人：成都艾伟孚生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51