用于动物胚胎解离的试剂盒和方法技术

本发明专利技术公开了用于动物胚胎解离的试剂盒和方法。本发明专利技术公开的用于动物胚胎解离的试剂盒包括名称分别为酶解溶液C、酶解溶液D和酶解溶液E的试剂；酶解溶液C由细胞松弛素储存液和TrypLE消化液组成，二者的体积比为3:47‑3:97；酶解溶液D为由胎牛血清、链霉蛋白酶溶液和TCM‑HEPES缓冲溶液组成的液体，三者的体积比为1:1:1‑1:2:1；酶解溶液E由细胞松弛素储存液和Accutase细胞分离液组成，二者的体积比为3:47‑3:97。实验证明，利用本发明专利技术的试剂盒和方法解离动物胚胎解离效率高，可以解离现有方法不能解离的物种胚胎，适用于不同发育阶段的胚胎，还可以减少解离过程中的对细胞造成的伤害。

Kit and method for animal embryo dissociation

The invention discloses a kit and a method for animal embryo dissociation. The kit for animal embryo dissociation disclosed by the invention includes reagents with the names of enzymolysis solution C, enzymolysis solution D and enzymolysis solution e respectively; enzymolysis solution C is composed of cytochalasin storage solution and TrypLE digestion solution, the volume ratio of which is 3:47-3:97; enzymolysis solution D is composed of fetal bovine serum, streptomycin protease solution and TCM \u2011 HEPES buffer solution, the volume of which is 3:47-3:97 The ratio is 1:1:1 \u2011 1:2:1; the enzymolysis solution e is composed of cytochalasin storage solution and accutase cell separation solution, and their volume ratio is 3:47 \u2011 3:97. Experiments show that the kit and method of the invention have high efficiency in dissociation of animal embryos, can dissociate species embryos that cannot be dissociated by the existing method, is suitable for embryos at different stages of development, and can also reduce the damage to cells in the process of dissociation.

【技术实现步骤摘要】
用于动物胚胎解离的试剂盒和方法
本专利技术涉及生物
中，用于动物胚胎解离的试剂盒和方法。
技术介绍
现在实验室最常见的将组织或培养的细胞解离成单细胞的方法就是酶解的方法，而胰酶因为价格便宜，作用强，成为现在实验室最常用的解离组织和细胞的酶。但是利用胰酶进行酶解具有以下缺点：1)由于胚胎的特殊性(外层有透明带，细胞之间连接致密，具有不同发育时段比如二细胞，四细胞到囊胚期)，采用胰酶酶解，存在效率低，且对于一些物种胚胎比如猪胚胎无法解离；2)解离效率不高，为了达到研究要求，需要解离更多胚胎，增加实验成本；3)对不同发育阶段胚胎需要采用不同方法或酶浓度，可能因为方法的不一导致结果的不均一性；4)胰酶本身作用比较强，容易造成细胞膜损伤，引起细胞凋亡，不利于后续研究等等。所以目前急需一种更稳定更高效且可通用的方法进行组织和细胞的解离。
技术实现思路
本专利技术所要解决的问题是如何提高动物胚胎的解离效率。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了一种可用于解离动物离体胚胎的试剂盒，所述试剂盒包括名称分别为酶解溶液C、酶解溶液D和酶解溶液E的试剂；所述酶解溶液C由细胞松弛素储存液和TrypLE消化液组成，所述酶解溶液C中所述细胞松弛素储存液与所述TrypLE消化液的体积比为3:47-3:97；所述细胞松弛素储存液为由细胞松弛素和水组成的无菌溶液；所述TrypLE消化液含有rProtase或Protase；所述酶解溶液D为由胎牛血清、链霉蛋白酶溶液和TCM-HEPES缓冲溶液组成的液体，所述酶解溶液D中胎牛血清、所述链霉蛋白酶溶液和所述TCM-HEPES缓冲溶液的体积比为1:1:1-1:2:1；所述链霉蛋白酶溶液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为链霉蛋白酶；所述TCM-HEPES缓冲溶液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质分别为NaHCO3、PyrovicAcid(Na-Salt)、HEPES(Na-Salt)、HEPES(Acid)、Medium199[10x]和L-Glutamine；所述酶解溶液E由所述细胞松弛素储存液和Accutase细胞分离液组成，所述酶解溶液E中所述细胞松弛素储存液和所述Accutase细胞分离液的体积比为3:47-3:97；所述Accutase细胞分离液含有ACCUTASEenzyme。所述试剂盒可由所述酶解溶液C、所述酶解溶液D、所述酶解溶液E和M组成；所述M为清洗试剂A和/或预处理试剂B；所述清洗试剂A为由溶剂和溶质组成的溶液，所述溶剂为水，所述溶质分别为白蛋白、磷酸二氢钾、氢氧化钠；所述预处理试剂B为由溶剂和溶质组成的溶液，所述溶剂为水，所述溶质为离子螯合剂以及用于调节pH的氢氧化钠。所述细胞松弛素储存液中所述细胞松弛素的浓度可为0.25mg/ml。所述细胞松弛素可为细胞松弛素B、细胞松弛素A、细胞松弛素C或细胞松弛素D。所述rProtase可为重组蛋白酶。所述TrypLE消化液具体可为Gibco产品，货号为12605010。所述链霉蛋白酶溶液中所述链霉蛋白酶的浓度可为70U/ml。所述TCM-HEPES缓冲溶液中所述溶质的浓度分别可为NaHCO30.0336g/200mL、PyrovicAcid(Na-Salt)0.044g/200mL、HEPES(Na-Salt)0.723g/200mL、HEPES(Acid)0.526g/200mL、Medium199[10x]20mL/200mL和L-Glutamine0.02922g/200mL。所述TCM-HEPES缓冲溶液中的NaHCO3、PyrovicAcid(Na-Salt)、HEPES(Na-Salt)、HEPES(Acid)、Medium199[10x]和L-Glutamine均可为sigma产品，货号分别为S-4019、P-3662、H-3784、H-4034、M-0650和G-8540。所述Accutase细胞分离液具体可为InnovativeCellTechnologies产品，货号为AT104。上述试剂盒中，所述清洗试剂A中所述溶质的浓度分别可为白蛋白(3-10)g/100mL、磷酸二氢钾0.68g/100mL、氢氧化钠0.1164g/100mL。所述白蛋白可为血清白蛋白，如牛血清白蛋白。上述试剂盒中，，所述预处理试剂B中所述离子螯合剂的浓度可为(0.037-0.111)g/100mL，所述预处理试剂B的pH可为6.8-7.2。进一步，所述预处理试剂B中所述离子螯合剂的浓度具体可为0.037g/100mL，所述预处理试剂B的pH具体可为6.2；或，所述预处理试剂B中所述离子螯合剂的浓度具体可为0.111g/100mL。所述预处理试剂B的pH具体可为7.2。上述试剂盒中，所述离子螯合剂可为乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)、氮川三乙酸(NTA)、二乙撑三胺五乙酸(DTPA)、N一羟乙基乙胺三乙酸(HEDTA)或乙二醇一双一(B一氨基乙醚)一N，N一四乙酸(EGTA)。所述试剂盒可用于动物离体胚胎解离。所述试剂盒中各试剂均可为无菌试剂。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了动物胚胎解离方法，所述方法包括：利用所述酶解溶液C处理待解离动物胚胎，得到初步解离的胚胎；利用所述酶解溶液D处理所述初步解离的胚胎，去除所述待解离动物胚胎的透明带，得到去除透明带的胚胎细胞团；利用所述酶解溶液E处理所述去除透明带的胚胎细胞团，实现所述待解离动物胚胎的解离。上述方法中，所述胚胎可为离体胚胎。上述方法中，所述利用所述酶解溶液C处理待解离动物胚胎可在离心条件下进行。所述离心的离心力可为9700g-11400g。所述离心的时间可为20-30min。上述方法中，利用所述酶解溶液D处理所述初步解离的胚胎的时间可为2～8分钟，如5分钟。上述方法中，利用所述酶解溶液E处理所述去除透明带的胚胎细胞团的时间可为20-60min。利用所述酶解溶液E处理所述去除透明带的胚胎细胞团时可利用外力实现所述酶解溶液E与所述去除透明带的胚胎细胞团中细胞的充分接触，如利用玻璃滴管反复吹打细胞。上述方法还可包括在利用所述酶解溶液D处理待解离动物胚胎前对所述待解离动物胚胎利用所述清洗试剂A进行清洗。上述方法还可包括在利用所述酶解溶液E处理所述去除透明带的胚胎细胞团前利用所述清洗试剂A对所述去除透明带的胚胎细胞团进行清洗。上述方法还可包括在所述初步解离后对得到的初步解离的胚胎利用所述清洗试剂A进行清洗。所述方法还可包括在利用所述酶解溶液C进行初步解离前利用所述预处理试剂B对所述待解离动物胚胎进行预处理。上述方法还可包括在利用所述酶解溶液C进行初步解离前或利用所述预处理试剂B进行预处理前利用所述清洗试剂A对所述待解离动物胚胎进行清洗。上述方法还可包括在利用所述预处理试剂B对所述待解离动物胚胎进行预处理后对得到的预处理后的胚胎利用所述清洗试剂A进行清洗。上述方法中，除利用所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种试剂盒，包括名称分别为酶解溶液C、酶解溶液D和酶解溶液E的试剂；/n所述酶解溶液C由细胞松弛素储存液和TrypLE消化液组成，所述酶解溶液C中所述细胞松弛素储存液与所述TrypLE消化液的体积比为3:47-3:97；所述细胞松弛素储存液为由细胞松弛素和水组成的溶液；/n所述酶解溶液D为由胎牛血清、链霉蛋白酶溶液和TCM-HEPES缓冲溶液组成的液体，所述酶解溶液D中胎牛血清、所述链霉蛋白酶溶液和所述TCM-HEPES缓冲溶液的体积比为1:1:1-1:2:1；所述链霉蛋白酶溶液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为链霉蛋白酶；所述TCM-HEPES缓冲溶液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质分别为NaHCO

【技术特征摘要】
1.一种试剂盒，包括名称分别为酶解溶液C、酶解溶液D和酶解溶液E的试剂；
所述酶解溶液C由细胞松弛素储存液和TrypLE消化液组成，所述酶解溶液C中所述细胞松弛素储存液与所述TrypLE消化液的体积比为3:47-3:97；所述细胞松弛素储存液为由细胞松弛素和水组成的溶液；
所述酶解溶液D为由胎牛血清、链霉蛋白酶溶液和TCM-HEPES缓冲溶液组成的液体，所述酶解溶液D中胎牛血清、所述链霉蛋白酶溶液和所述TCM-HEPES缓冲溶液的体积比为1:1:1-1:2:1；所述链霉蛋白酶溶液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为链霉蛋白酶；所述TCM-HEPES缓冲溶液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质分别为NaHCO3、PyrovicAcid(Na-Salt)、HEPES(Na-Salt)、HEPES(Acid)、Medium199[10x]和L-Glutamine；
所述酶解溶液E由所述细胞松弛素储存液和Accutase细胞分离液组成，所述酶解溶液E中所述细胞松弛素储存液和Accutase细胞分离液的体积比为3:47-3:97；所述Accutase细胞分离液含有ACCUTASEenzyme。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒由所述酶解溶液C、所述酶解溶液D、所述酶解溶液E和M组成；所述M为清洗试剂A和/或预处理试剂B；
所述清洗试剂A为由溶剂和溶质组成的溶液，所述溶剂为水，所述溶质分别为白蛋白、磷酸二氢钾、氢氧化钠；
所述预处理试剂B为由溶剂和溶质组成的溶液，所述溶剂为水，所述溶质为离子螯合剂以及用于调节pH的氢氧化钠。


3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述细胞松弛素储存液中所述细胞松弛素的浓度为0.25mg/ml；
和/或，所述链霉蛋白酶溶液中所述链霉蛋白酶的浓度为70U/ml；
和/或，所述TCM-HEPES缓冲溶液中所述溶质的浓度分别为NaHCO30.0336g/200mL、PyrovicAcid(Na-Salt)0.044g/200mL、HEPES(Na-Salt)0.723g/200mL、HEPES(Acid)0.526g/200mL、Medium199[10x]20mL/2...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘田宾，李静，孙海汐，李勇，顾颖，沈玥，
申请(专利权)人：深圳华大生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44