本产品涉及一种利用维斯假丝酵母生物法合成生产长链十二碳二元酸的方法，包括以下步骤：种子培养阶段、发酵培养阶段与十二碳二元酸分离回收阶段，所述维斯假丝酵母的保藏号CCTCC No.2019076。其中，所述种子培养阶段获得的种子液的菌株生长OD值达到0.6～0.85。本发明专利技术方法生产的正十二碳二元酸具有令人满意的结晶形态，更容易满足欧洲、美国、日本无尘化、低粉尘产品出口要求；而且特别适合作为高级润滑油、高级尼龙树脂的原料加工利用。
A method of producing dodecyl dicarboxylic acid by Candida Weiss
【技术实现步骤摘要】
一种维斯假丝酵母发酵生产十二碳二元酸的方法
本专利技术属于生物化工领域，涉及一种维斯假丝酵母发酵生产十二碳二元酸的方法及产品与菌种。
技术介绍
长链二元酸是指碳原子数在十个以及以上的二元酸，一般指直链二元酸。十二碳二元酸(DC12)是合成高性能尼龙工程塑料尼龙1212和服装用高档尼龙热熔胶和高级涂料的重要原料。DC12可以通过微生物发酵或化学合成两种方法制备生产。传统的生产长链二酸的化学方法需要9个复杂的反应步骤,高温、高压和催化剂；生产时需要防火、防爆和防毒装置，收率低、成本高和环境污染严重。而生物发酵法合成工艺简单，常温常压下就能生产，无污染、收率高，具备成本优势。国内外生产菌株的α、ω-氧化能力强较强，产酸可达200g/L，如中国专利CN1233658A、CN1130685A、CN1162644A、CN1369464A、CN1092108A、CN1034579A、CN1046757A分别公开了通过硝基胍、亚硝酸和紫外线多次反复诱变，选育ω-氧化能力更强的热带假丝酵母突变株并以烷烃作为生长碳源公开了一种生产长链二元酸的热带假丝酵母菌的筛选方法，该方法能快速而高效的获得α、ω-氧化能力强的热带假丝酵母突变菌株，其部分解决长链二元酸发酵生产效率的低的问题：如专利CN1928100A中DC12生产率为1.3g/L·h，专利CN10225411A中混合二元酸的生产率仅为0.92g/L·h。中国专利CN104862348A、CN105755062A公开了使用维斯假丝酵母发酵生产十二碳二元酸的方法，通过分离耦合装置或氧化还原电位控制发酵过程部分提高了生产效率至1.78～2.0g/L·h，但上述方法操作步骤较为复杂，且并没有缩短整个发酵周期，占用生产设备时间较长，不能解决二元酸工业化难题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种维斯假丝酵母发酵生产十二碳二元酸的方法及产品与菌种，该方法是基于以下发现：通过在含烷烃(生产使用废弃石蜡油)废渣中以基因高通量筛选结合特定化学诱变方法，筛选出一株维斯假丝酵母(Candidaviswanathiiws-1201，保藏号CCTCCNo.2019076，保藏日期为2019年1月23日，保藏地点为武汉大学，中国典型培养物保藏中心)，其一方面能保持现有高水平发酵生产DC12的能力或略有提高，又极大地缩短了发酵生产DC12的发酵时间，使得维斯假丝酵母发酵生产十二碳二元酸的工业化成为可能。该菌株发酵并使用本专利技术的精制方法获得产品十二碳二元酸，形态为具有较为紧密结晶体的结构，大大减少了粉末程度的同时，减少了产品包装尺寸，使得产品更容易达到后续工艺无尘化和低尘化要求的同时，更利于长途集装箱的运输并减少货柜装量。维斯假丝酵母(Candidaviswanathiiws-1201)的培养特征如下：原料包括碳源的混合物，包含一种或多种选自糖、纤维素、烷烃、脂肪酸、三酰甘油、石蜡等或它们的组合的碳源。氮可自无机(例如，(NH4)2SO4)或有机来源(例如，脲或谷氨酸)供应。除合适的碳源和氮源外，培养基还可含有适合微生物培养的适当矿物质、盐、辅因子、缓冲液、维生素、金属离子(例如，Mn+2、Co+2、Zn+2、Mg+2)和其他组分。或使用酵母复合培养基(例如，酵母提取物-蛋白胨-右旋糖肉汤(YPD))或其他可商品化制备的(如酵母氮基料(DIFCOLaboratories,Detroit,Mich.)通用酵母培养基中培养维斯假丝酵母。在本专利技术的一个优选斜面培养基为麦芽汁琼脂培养基。液体发酵培养基包括：碳源10-90g/L，金属磷酸盐4～15g/L，最好为6～10g/L，酵母膏3～8g/L，玉米浆3～8g/L，尿素0.5-1.5g/L，NaCl0.5-1g/L,钾盐1-10g/L，消泡剂0.5-1.5g/L。专利技术所述的发酵转化正十二烷(nC12)生产十二碳二元酸(DC12)的方法是以热带假丝酵母维斯假丝酵母(Candidaviswanathiiws-1201)为发酵菌种，在以正十二烷(nC12)为基质的发酵培养基中同步发酵，生产α，ω-正十二碳二元酸。专利技术所述的发酵转化正十二烷(nC12)生产十二碳二元酸(DC12)的方法的步骤为：第一阶段为维斯假丝酵母(Candidaviswanathiiws-1201)的种子培养，即将维斯假丝酵母(Candidaviswanathiiws-1201)接入发酵培养基，28～29℃220转/分的旋转摇床上培养40～24小时，菌株生长OD值达到0.6～0.85时，作为发酵液的种子。应当明确，以上种子培养基及培养方法仅为优选方法，在本专利技术说明书给出了该菌株的培养特征、营养特征的前提下，可以对上述条件进行改变，只要使得菌株生长正常能够达到OD值达到0.6～0.85，作为发酵液的种子即可。第二阶段为维斯假丝酵母(Candidaviswanathiiws-1201)的发酵产酸阶段，即将培养成的种子液接入pH值为5.5～9.0含有5～40％(v/v)12个碳原子的正烷烃和60～95％(v/v)发酵培养基的混合液中。所述混合液24～29℃转化48～52小时，然后将生产的十二碳二元酸进行分离纯化。更优选地，所述混合液在pH6.0～7.5下24～29℃下转化52小时，然后将生产的十二碳二元酸进行分离纯化。更优选地，从24小时开始，每天补加一定量正烷烃，使发酵液中正烷烃浓度始终＞20％(v/v)。优选地，本专利技术还包括将发酵液中产物十二碳二元酸分离回收阶段：即发酵结束后，将发酵液加热加碱破乳，加热至80-90℃，加碱至pH10左右，压入静置分层罐分层。优选地，本专利技术还包括将残余正烷烃回收再用的步骤，即膜分离除去菌体，清液放置，冷却至20℃，收集DC12钠盐的晶体，母液直接酸化结晶，收集DC12钠盐和DC12，用水或有机溶剂进行重结晶，得到DC12白色结晶。本专利技术与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：用本专利技术的维斯假丝酵母(Candidaviswanathiiws-1201)菌株和发酵方法，可在工业化发酵罐，从nC12发酵生产DC12时，培养52h时产酸142g/L。发酵52h结束，平均产酸速率为2.73g/h·L，转化率93.2％。DC12纯度达到99％以上，其中一元酸的含量小于0.01％。此外，令人意外地，本专利技术的DC12生产产品具有令人满意的片层状形态，这对欧洲无尘化、低粉尘产品进口要求而言更具有竞争力。具体实施方式在本专利技术的一个实施例中，提供了利用生物法合成生产长链十二碳二元酸的方法，包括以下步骤：(1)维斯假丝酵母Candidaviswanathiiws-1201种子培养阶段；(2)维斯假丝酵母Candidaviswanathiiws-1201发酵培养阶段；(3)发酵液中产物十二碳二元酸分离回收阶段，其中，所述维斯假丝酵母Candidaviswanathiiws-1201的保藏号CCTCCNo.2019076。优选地，在本专利技术的一个实施例中，所述维斯假丝酵母本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种利用生物法合成生产长链十二碳二元酸的方法，包括以下步骤：/n(1)维斯假丝酵母Candida viswanathii ws-1201种子培养阶段；/n(2)维斯假丝酵母Candida viswanathii ws-1201发酵培养阶段；/n(3)发酵液中产物十二碳二元酸分离回收阶段，其中，/n所述维斯假丝酵母Candida viswanathii ws-1201的保藏号CCTCC No.2019076。/n
【技术特征摘要】
1.一种利用生物法合成生产长链十二碳二元酸的方法，包括以下步骤：
(1)维斯假丝酵母Candidaviswanathiiws-1201种子培养阶段；
(2)维斯假丝酵母Candidaviswanathiiws-1201发酵培养阶段；
(3)发酵液中产物十二碳二元酸分离回收阶段，其中，
所述维斯假丝酵母Candidaviswanathiiws-1201的保藏号CCTCCNo.2019076。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述维斯假丝酵母Candidaviswanathiiws-1201的种子培养阶段为：将维斯假丝酵母Candidaviswanathiiws-1201接种至发酵培养基中生产菌体。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基包括碳源10-90g/L，金属磷酸盐4～15g/L，最好为6～10g/L，酵母膏3～8g/L，玉米浆3～8g/L，尿素0.5-1.5g/L，NaCl0.5-1g/L，钾盐1-10g/L，吐温0.5-1.5g/L。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基包括碳源10-90g/L，金属磷酸盐为6～10g/L，酵母膏3～8g/L，玉米浆3～8g/L，尿素0.5-1.5g/L，NaCl0.5-1g/L，钾盐1-10g/L，吐温0.5-1.5g/L。
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【专利技术属性】
技术研发人员：王绍冰，修德恒，万贺飞，
申请(专利权)人：张艾琳，
类型：发明
国别省市：山东;37
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