一种巴斯德毕赤酵母、产生的耐高温酶及应用制造技术

本发明专利技术提供一种巴斯德毕赤酵母、产生的耐高温蛋白酶及应用，属于微生物技术领域；本发明专利技术通过选育一种可产生耐高温酶的巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)AN‑PK‑9K‑GS115，然后将其进行培养，从发酵液中提取耐高温蛋白酶，将其用于羽毛粉的水解，可以有效水解羽毛粉，将其中蛋白质组分高效降解为小肽成分或者氨基酸成分，从而提高蛋白质的消化率，增加采食量，提高动物健康水平。

A Pichia pastoris, thermotolerant enzyme and its application

【技术实现步骤摘要】
一种巴斯德毕赤酵母、产生的耐高温酶及应用
本专利技术涉及微生物
，具体涉及一种巴斯德毕赤酵母、产生的耐高温蛋白酶及应用。
技术介绍
羽毛粉可广泛用于畜禽水产等高蛋白质饲料，蛋白质含量可高达80％，氨基酸组份比较齐全，其赖氨酸、蛋氨酸低于进口鱼粉外，其余微量元素均高于鱼粉，而且胱氨酸的含量居所有天然饲料之首，是很好的蛋白质饲料资源。在春秋换毛季节饲喂食羽毛粉,对毛绒的生长发育有利，同时还有减少鸡,鸭,啄肛,跳毛,貂、狐自咬和食毛现象的作用。羽毛粉为全营养食品，能提高皮毛动物健康水平，提高繁育能力，促进皮毛状况的改善，毛色变得更加健康、光泽。羽毛的主要成分为蛋白质，分子量较大，不易被动物体吸收，因此需要用蛋白酶先进行水解，将其分解为可以为动物体吸收利用的小分子多肽或氨基酸，从而增加蛋白质的消化率，改善蛋白质生物学效价。但是一般的蛋白酶对羽毛粉的水解效果均不太理想，究其原因，是由于蛋白酶的制备过程中有一个高温干燥的过程，一般的蛋白酶在高温下容易降低活性甚至失活。
技术实现思路
本专利技术目的之一在于提供一种可产生耐高温酶的巴斯德毕赤酵母，目的之二在于提供这种酵母产生的耐高温蛋白酶在水解羽毛粉方面的应用。本专利技术为解决上述技术问题，所采用的技术方案如下：技术方案一：一种巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)AN-PK-9K-GS115，保藏编号为：CCTCCNO：M2019593；其通过如下方法进行选育：A、以枯草芽孢杆菌中蛋白酶表达基因为原始基因来源；B、利用重叠延伸PCR技术获得目的基因序列Fpk；C、将目的基因插入表达载体：插入构建的常规的巴斯德毕赤酵母表达载体p9kNTS、p9kMFⅡ，插入位点为EcoR1/Not1：D、将上述表达载体进行重组和线性化；E、电转化巴斯德毕赤酵母工程菌：经重组和线性化后，电转化；F、初筛、复筛，最后获得目标菌株。作为本专利技术的进一步改进，所述的步骤F具体过程为：摇瓶酶活测定筛选，以筛选到的p9kNTS-Fpk-GS115作为宿主菌，将重组质粒p9kNTS-Fpk、p9kMFⅡ-Fpk线性化后进行二次电转化，再依次进行10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL的G418梯度高拷贝筛选，并利用福林酚比色法进行蛋白酶酶活检测，获得目标菌株。G418(Geneticin,遗传霉素)是一种氨基糖苷类抗生素,在分子遗传试验中，是稳定转染最常用的抗性筛选试剂。它通过抑制转座子Tn601，Tn5的基因,干扰核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核和真核等细胞产生毒素,包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞,也包括原生动物和蠕虫。当neo基因被整合进真核细胞DNA后,则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA,从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达,使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长。G418的这一选择特性,已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。技术方案二：一种由巴斯德毕赤酵母产生的耐高温蛋白酶，其氨基酸序列表如SEQIDNO:2所示。进一步的，在20～80℃的条件下具有活性和热稳定性，在65℃条件下，活性可保持3h不变，在40～50℃的条件下，24h后有60％以上的活性；在pH6～11范围内均有活性，当pH7～9时24h内酶活性保存率为100％。作为本专利技术的进一步改进，获取过程如下：将巴斯德毕赤酵母AN-PK-9K-GS115通过甲醇补料发酵后，将发酵液经过板框过滤，再进一步喷雾干燥制成粉末状酶制剂，即为耐高温蛋白酶。耐高温蛋白酶活力大于等于50000U/mL，小于等于100000U/mL，比活力大于等于3000U/mg，小于等于5000U/mg。技术方案三：编码由SEQIDNO:2的氨基酸序列组成的耐高温蛋白酶的编码基因。进一步的，编码基因由SEQIDNO:1的核苷酸序列组成的耐高温蛋白酶基因。技术方案四：上述耐高温蛋白酶在酶解羽毛粉方面的应用，水解羽毛粉的方法如下：将耐高温蛋白酶按照料水比1:10加入到羽毛粉培养基中，在酶活1000-1500U/g、温度65℃、pH9.0条件下酶解3-4h。除羽毛粉以外，本专利技术获得的耐高温蛋白酶在水解血粉、肉骨粉、蚕蛹和豆粕方面也有较佳的效果。与现有技术相比，本专利技术具有如下技术效果：本专利技术所述的巴斯德毕赤酵母AN-PK-9K-GS115(pichiapastorisAN-PK-9K-GS115)是由毕赤酵母通过基因工程手段改造而成的，其形态及生理生化特征包括：呈乳白色，菌体镜检呈椭圆形或圆形，为甲醇营养型菌。可以产生能够有效水解羽毛粉的耐高温蛋白酶。本专利技术产生的高温蛋白酶在20～80℃的条件下具有活性和热稳定性，在65℃条件下，活性可保持3h不变，在40～50℃的条件下，24h后有60％以上的活性；在pH6～11范围内均有活性，当pH7～9时24h内酶活性保存率为100％；可以有效水解羽毛粉，将其中蛋白质组分高效降解为小肽成分或者氨基酸成分，从而提高蛋白质的消化率，增加采食量，提高动物健康水平。本专利技术对羽毛粉的液体酶解方法操作简便，有利于节省时间，降低工业成本。本专利技术对羽毛粉的处理温和无污染，不会破坏羽毛粉中的营养成分，具有较好的应用前景。本分明对羽毛粉的充分利用，可以有效缓解饲料蛋白质资源的不足，促进畜牧业和饲料产业的发展。为提高羽毛粉的水解效果，可以先用NaOH稀溶液对羽毛进行预处理，以破坏羽毛本身的致密结构。镁离子可以作为金属离子螯合剂，一定浓度范围内可以提高蛋白酶活性。为进一步提高羽毛粉的水解效果，在水解过程中可以添加镁离子溶液。本专利技术的巴斯德毕赤酵母AN-PK-9K-GS115(pichiapastorisAN-PK-9K-GS115)，保藏号为CCTCCNO：M2019593，保藏日期为2019年7月30日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术所述的枯草芽孢杆菌为市售产品，以下实施例均为购买的北京三药的枯草芽孢杆菌，货号：SP02568,规格：103cfu/颗；有效期：12个月；储存：-20℃或-20℃以下；菌株来源：由中国医学细菌保藏管理中心(NationalCenterForMedicalCultureCollections,CMCC)提供的0代菌种生产；传代次数：第4代。实施例1：本实施例所述巴斯德毕赤酵母AN-PK-9K-GS115通过如下方法进行选育：A、以购买自北京三药的枯草芽孢杆菌为原始基因来源本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)AN-PK-9K-GS115，保藏编号为：CCTCC NO：M2019593；/n其通过如下方法进行选育：/nA、以枯草芽孢杆菌中蛋白酶表达基因为原始基因来源；/nB、利用重叠延伸PCR技术获得目的基因序列Fpk；/nC、将目的基因插入表达载体：插入构建的常规的巴斯德毕赤酵母表达载体p9kNTS、p9kMFⅡ，插入位点为EcoR1/Not1：/nD、将上述表达载体进行重组和线性化；/nE、电转化巴斯德毕赤酵母工程菌：经重组和线性化后，电转化；/nF、初筛、复筛，最后获得目标菌株。/n

【技术特征摘要】
1.一种巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)AN-PK-9K-GS115，保藏编号为：CCTCCNO：M2019593；
其通过如下方法进行选育：
A、以枯草芽孢杆菌中蛋白酶表达基因为原始基因来源；
B、利用重叠延伸PCR技术获得目的基因序列Fpk；
C、将目的基因插入表达载体：插入构建的常规的巴斯德毕赤酵母表达载体p9kNTS、p9kMFⅡ，插入位点为EcoR1/Not1：
D、将上述表达载体进行重组和线性化；
E、电转化巴斯德毕赤酵母工程菌：经重组和线性化后，电转化；
F、初筛、复筛，最后获得目标菌株。


2.根据权利要求1所述的巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)AN-PK-9K-GS115，其特征在于，所述的步骤F具体过程为：摇瓶酶活测定筛选，以筛选到的p9kNTS-Fpk-GS115作为宿主菌，将重组质粒p9kNTS-Fpk、p9kMFⅡ-Fpk线性化后进行二次电转化，再将转化子依次在浓度为10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL的G418平板上划线筛...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭楠，刘玲，常章兵，田建平，梁运祥，
申请(专利权)人：华中农业大学，四川润格生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42