一种低温产纤维素酶的酵母菌及其筛选方法技术

本发明专利技术涉及一种低温产纤维素酶的酵母菌及其筛选方法，包括酵母菌，其保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18002，保藏日期为2019年6月19日。本发明专利技术从不同低温地区土壤的中分离筛选高效低温纤维素酶酵母菌，酵母菌其生物学特征为:在马铃薯葡萄糖培养基上为乳白色圆形菌落，表面稍干燥，菌落厚，易挑起，有酒香味，呈现典型的酵母菌菌落；并研究其对温度、碳源、氮源、pH等的条件对纤维素酶影响。再通过应用在东北低温寒冷地区秸秆还田上，减少东北地区秸秆焚烧对环境的影响，为农业可持续发展奠定坚实基础。

A low temperature Cellulase Producing Yeast and its screening method

【技术实现步骤摘要】
一种低温产纤维素酶的酵母菌及其筛选方法
本专利技术涉及一种低温产纤维素酶的酵母菌及其筛选方法，属于微生物学领域。
技术介绍
低温微生物是指在低温环境下具有生长繁殖能力的微生物群体，它们在各种低温的环境中生长繁殖。根据微生物的生长温度的选择，将低温微生物分为两类，嗜冷型和耐冷型两种微生物，其中嗜冷型微生物的能够生长、繁殖的，而最适温度是在15℃左右，可以生存的温度是在20℃左右的微生物；耐冷型微生物是生存温度在0℃左右，能够生长、繁殖的最适温度在20℃左右的微生物。在生物圈中存在非常丰富的微生物资源和低温微生物资源，因此将微生物资源充分的运用到生活、生产实践中，而低温微生物的生长、繁殖的温度一般在常温下就可以进行，无需使用其他能源，极易得到，分布的也较为广泛，因此人们开始致力于研究低温微生物，也受到了一些专家和学者的关注。目前为止，对于低温微生物的开发和利用上相对较少，从国内外的研究进展来看，仍然是研究中、高温微生物的居多，而且对于土壤低温微生物降解菌的研究甚少。迄今，国内外有记录报道的能够分泌纤维素酶的微生物菌种多为一些真菌菌群，比如：木霉菌、曲霉菌等，低温产纤维素酶的酵母菌报道极少。并且现阶段研究的产酶菌株种类有限，且多存在生产成本高、产酶能力和产酶量不够高效稳定、pH适应范围狭窄等缺陷，因此有必要继续探寻和开发高活性、作用范围更广泛的新菌种，进一步拓展纤维素酶类来源思路。但国内外学者对中高温纤维素酶的关注较高，对低温条件下产纤维素酶的菌涉猎不多。低温纤维素酶，在节能和降低成本方面更具优势和潜力，极具开发前景。总之，一株低温产纤维素酶的酵母菌及其筛选方法尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术目的是针对上述问题，提供了一株低温产纤维素酶的酵母菌筛选方法及应用。为了实现本专利技术的上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种低温产纤维素酶的酵母菌，酵母菌H4的保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，酵母菌H4保藏编号为CGMCCNo.18002，保藏日期为2019年6月19日。该菌26SrDNA序列发表在GenBank，登陆号为DPYBCB8U014，其26SrDNA序列为：Tatgtcacatcctaagcacgtacgtggacgaatcccggccataaaggcgtgctgcgttcctcagtcccaaccactgtatgtgacaggaggctataagtttacccgagggtactacgttcctccagcctttatccagcgatcaaaactgatgttgaccccactcaaaggaagtacaccggcagaaccggctgaatccaaagagcacgactgacttcaatcgtttccctttcaacaatttcacatactgtttaactctctttccaaagtgcttttcatctttccctcacggtacttgttcgctatcggtctctcgccaatatttagctttagatggaatttaccacccattttgagctgcattcccaaacaactcgactcgttgaaaatgtatcacagagcactggtagttcatgtcaaggacgggattctcaccctctatgacgccctgttccaagggacttgtacatgagccagcacggaaaacacttctatagattacaactcggatgacctgaggccaccagatttcaaatttgagctcttcccgcttcactcgccgttactaggggaatccttgttagtttcttttcctccgcttccgggtatatgca。酵母菌生物学特征是在马铃薯葡萄糖培养基上为乳白色圆形菌落，表面稍干燥，菌落厚，易挑起，有酒香味，呈现典型的酵母菌菌落。菌株的分离方法：将采集的东北地区寒地森林土壤悬液按10％的接种量接种于含有100mg/L秸秆粉末的无机盐培养基中，10℃下摇床150r/min，培养3天后，以5℃下10％接种量转至秸秆浓度为300mg/L的无机盐培养基中，继续培养；按此方式连续循环3次，三次所用的无机盐培养基中的秸秆浓度依次为300mg/L、600mg/L、1000mg/L，然后进行平板涂布，将培养皿放于5℃恒温培养箱中培养72h，挑取单菌落，转接入秸秆浓度为1000mg/L的无机盐培养基中，得到秸秆降解菌菌悬液。无机盐培养基的组成为(NH4)2SO42g，KH2PO42g，Na2HPO41.3g，秸秆100～1000mg，NaCl5g，余量为水定容到1L；培养基的PH＝4.8～7.2。菌株的发酵条件优化：a、碳源对酵母菌H4生长及纤维素酶的影响；选取葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、玉米粉、甘油、乳糖、果糖、甘露醇、柠檬酸、可溶性淀粉中一种碳源为培养基中的碳源，配置液体培养液；取1mL酵母菌H4种子培养液接种于培养液中，1000mg/L无机盐液体秸秆粉发酵培养基，20℃120rmp振荡培养2d后，13000rmp离心15min，测定上清液中纤维素酶含量，同时测定培养液中菌悬液浓度，筛选碳源；b、不同氮源对酵母菌H4生长及纤维素酶的影响；选取蛋白胨、酵母膏、黄豆粉、干酪素、尿素、硫酸铵、硝酸钾、牛肉膏中一种氮源为培养基中的氮源，配置氮源液体培养液；其余方法同上，测定上清液中纤维素酶含量，同时测定培养液中菌悬液浓度，筛选氮源；c、不同无机盐对酵母菌H4生长及纤维素酶的影响；以MgSO4、NaCl、KH2PO4、为培养基中的无机盐，配置不同无机盐的液体培养液。其余方法同上，测定上清液中纤维素酶含量，同时测定培养液中菌悬液浓度，筛选无机盐。d、不同初始pH对酵母菌H4生长及纤维素酶的影响配置pH值2，3，4，5，6，7，8，9，10，11的液体培养基。其余方法同上，测定上清液测定上清液中纤维素酶含量，同时测定培养液中菌悬液浓度，筛选初始pH值。e、不同温度对H4菌株生长及纤维素酶的影响配置液体培养基；取1mL酵母菌H4种子培养液接种于液体培养液中，放置于温度分别为15℃，20℃，25℃，30℃，35℃，40℃的振荡培养箱中，其余方法同上，测定上清液中纤维素酶含量，同时测定培养液中菌悬液浓度，筛选温度。一种低温产纤维素酶的酵母菌的筛选方法，筛选步骤如下：a、初筛：将5ml，1000mg/L无机盐培养基加到15mm×150mm试管中，在121℃下灭菌30min后，冷却至室温，然后将1ml秸秆降解菌菌悬液加入到试管中，每株菌重复2管，5℃低温避光培养5天，每24h观察记录1次生长情况；将纯化后的菌株点种到纤维素刚果红培养基上，5℃培养4天，根据水解圈直径D与菌落直径d比值D/d的大小进行初选,即D/d值越大越好；b、复筛：将50ml，1000mg/L无机盐培养基加到250ml三角瓶中,在121℃下灭菌30min后，冷却至室温，然后将每个三角瓶中加入1ml初筛得到的秸秆降解菌菌悬液，5℃下避光培养10天，检测秸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种低温产纤维素酶的酵母菌，其特征在于，酵母菌H4的保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，酵母菌H4保藏编号为CGMCC No.18002，保藏日期为2019年6月19日。/n

【技术特征摘要】
1.一种低温产纤维素酶的酵母菌，其特征在于，酵母菌H4的保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，酵母菌H4保藏编号为CGMCCNo.18002，保藏日期为2019年6月19日。


2.根据权利要求1所述的一种低温产纤维素酶的酵母菌，其特征在于，该菌26SrDNA序列发表在GenBank，登陆号为DPYBCB8U014，其26SrDNA序列为：
Tatgtcacatcctaagcacgtacgtggacgaatcccggccataaaggcgtgctgcgttcctcagtcccaaccactgtatgtgacaggaggctataagtttacccgagggtactacgttcctccagcctttatccagcgatcaaaactgatgttgaccccactcaaaggaagtacaccggcagaaccggctgaatccaaagagcacgactgacttcaatcgtttccctttcaacaatttcacatactgtttaactctctttccaaagtgcttttcatctttccctcacggtacttgttcgctatcggtctctcgccaatatttagctttagatggaatttaccacccattttgagctgcattcccaaacaactcgactcgttgaaaatgtatcacagagcactggtagttcatgtcaaggacgggattctcaccctctatgacgccctgttccaagggacttgtacatgagccagcacggaaaacacttctatagattacaactcggatgacctgaggccaccagatttcaaatttgagctcttcccgcttcactcgccgttactaggggaatccttgttagtttcttttcctccgcttccgggtatatgca。


3.根据权利要求1所述的一种低温产纤维素酶的酵母菌，其特征在于，酵母菌生物学特征是在马铃薯葡萄糖培养基上为乳白色圆形菌落，表面稍干燥，菌落厚，易挑起，有酒香味，呈现典型的酵母菌菌落。


4.根据权利要求1所述的一种低温产纤维素酶的酵母菌，其特征在于，
菌株的分离方法：
将采集的东北地区寒地森林土壤悬液按10％的接种量接种于含有100mg/L秸秆粉末的无机盐培养基中，10℃下摇床150r/min，培养3天后，以5℃下10％接种量转至秸秆浓度为300mg/L的无机盐培养基中，继续培养；按此方式连续循环3次，三次所用的无机盐培养基中的秸秆浓度依次为300mg/L、600mg/L、1000mg/L，然后进行平板涂布，将培养皿放于5℃恒温培养箱中培养72h，挑取单菌落，转接入秸秆浓度为1000mg/L的无机盐培养基中，得到秸秆降解菌菌悬液。


5.根据权利要求4所述的一种低温产纤维素酶的酵母菌，其特征在于，
无机盐培养基的组成为(NH4)2...

【专利技术属性】
技术研发人员：何志刚，隋国民，宋艳雨，刘惠屿，刘艳，
申请(专利权)人：辽宁省农业科学院，
类型：发明
国别省市：辽宁;21