赭曲霉毒素A基因敲除的赭曲霉突变菌株及其构建和应用制造技术

本发明专利技术提供了赭曲霉毒素A基因敲除的赭曲霉突变菌株及其构建和应用。所述的赭曲霉毒素A基因敲除的赭曲霉突变菌株，保藏编号为CCTCC NO：M2019186。本发明专利技术通过同源重组的方式，将抗性标记基因插入聚酮合酶基因pks中，敲除pks基因得到赭曲霉突变菌株。该菌株失去合成聚酮合酶的能力，进而阻断了OTA的合成，为其在工业生产中的广泛应用奠定基础。

Construction and application of ochratoxin A gene knockout ochratoxin mutant strain

【技术实现步骤摘要】
赭曲霉毒素A基因敲除的赭曲霉突变菌株及其构建和应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种赭曲霉毒素A基因敲除的赭曲霉突变菌株及其构建方法。
技术介绍
赭曲霉是隶属于曲霉属的一种丝状真菌，在全世界范围内广泛分布。由于其生长能力强且具有多样化的碳水化合物水解作用和蛋白水解作用，常被应用于发酵工程和生物医药工程等领域。在制药工业领域，赭曲霉主要用于转化环氧黄体酮，进行甾体类药物的C11α-羟基化反应，如制备心血管药物C11α-羟基-坎利酮及其它甾体类药物。此外，赭曲霉具有丰富的碳水化合物水解酶系，在食品、纺织和纸浆等工业生产中起到非常重要的作用。然而，其次级代谢产物赭曲霉毒素又是危害食物产品安全与人类健康的因素之一，严重制约了赭曲霉在制药和食品等相关领域的应用。赭曲霉毒素包括7种结构类似的化合物，其中以赭曲霉毒素A(OTA)毒性最大，污染最严重。OTA性质稳定，耐酸，耐高温，不易降解，食品一旦污染OTA，要完全去除非常困难。Marino等人研究表明，在玉米、小麦等谷物以及咖啡、啤酒、牛奶、葡萄、橘子和果汁饮料等多种食品产品中都能检测到赭曲霉及其分泌物OTA的污染。Petzinger等人报道，OTA具有强烈的肝脏和肾脏毒性以及潜在的致癌和致突变能力，国际癌症研究机构(LARC)己将OTA认定为2B类致癌物(即可能引起人类癌症的物质)。OTA的污染严重威胁了食品安全和人类生存环境。因为赭曲霉强大的OTA分泌能力，所以一定程度上限制了其在工业生产中的广泛应用。目前报道了多种控制OTA的方法，其中生物防治安全环保，具有一定的实用价值，但不能从根本上解决问题。随着新型分子生物学方法的应用，一些具有应用价值的快速检测技术和降低毒素产生的方法得以开发，但OTA合成代谢通路及基因调控网络机制仍有待研究。O’Callaghan等使用抑制差杂交PCR方法克隆了一株赭曲霉中聚酮合酶(PKS)编码基因片段(GenBank登录号AAT92023.1)。通过反转录PCR研究发现该pks基因表达仅发生在OTA合成早期，且敲除该pks基因的突变菌株不能生成OTA，表明pks基因与OTA的合成有关。Bacha等利用基因步查(geneWalking)方法克隆了一株赭曲霉pks基因片段(GenBank登录号AAT92024.1)。基于反转录PCR和动态次级代谢合成研究进一步证实pks基因的表达与OTA的合成相关。Han等研究表明OTA的生物合成由cluster37和cluster69两个基因簇共同完成，其核心基因分别为pks和nrps。而这两个核心基因与上述两个pks基因同源，说明OTA由两个PKS共同催化合成。
技术实现思路
本专利技术目的是提供赭曲霉毒素A基因敲除的赭曲霉突变菌株及其构建方法。利用基因工程方法敲除赭曲霉中的pks基因，以获得失去产OTA能力的赭曲霉突变菌株。从源头上解决OTA污染问题，为赭曲霉菌株的工业化应用提供安全菌株。为了达到上述目的，本专利技术提供了一种赭曲霉毒素A基因敲除的赭曲霉突变菌株，该突变菌株赭曲霉(Aspergillusochratae)MF018现保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2019年3月21日，保藏编号为CCTCCNO：M2019186。本专利技术还提供了上述的赭曲霉毒素A基因敲除的赭曲霉突变菌株的构建方法，其特征在于，包括：步骤1：克隆赭曲霉聚酮合酶编码基因pks；步骤2：克隆选择性标记抗性基因；步骤3：构建含有pks上下游关键DNA序列p-u1、p-d1和所述的选择性标记抗性基因的融合基因，并将融合基因插入质粒构建重组质粒；步骤4：重组质粒转化大肠杆菌DH5α，培养并筛选转化子进行重组质粒验证；步骤5：制备赭曲霉原生质体；步骤6：重组质粒转化赭曲霉原生质体；步骤7：培养和筛选转化后的赭曲霉获得赭曲霉阳性转化子；步骤8：对阳性转化子进行基因水平的验证，获得赭曲霉毒素A基因敲除的赭曲霉突变菌株。优选地，所述的赭曲霉突变菌株不合成赭曲霉毒素A。优选地，所述的质粒为pSilent-Dual1、pBC-Hygro、pAg1-H3和pMD18-T中的至少一种。优选地，所述的p-u1为上游交换臂，p-d1为下游交换臂。优选地，所述的步骤4中筛选所用抗性标记为氨苄青霉素、氯霉素或卡那霉素，浓度为10-60μg/mL。优选地，所述的步骤7中筛选所用抗性标记为博来霉素或潮霉素，浓度为20-150μg/mL。本专利技术还提供了上述的赭曲霉毒素A基因敲除的赭曲霉突变菌株在发酵工程或生物医药工程领域中的应用。本专利技术还提供了上述的赭曲霉毒素A基因敲除的赭曲霉突变菌株在制备甾体类药物中的应用。本专利技术还提供了一种重组质粒，其特征在于，含有pks上下游关键DNA序列p-u1、p-d1和所述的选择性标记抗性基因的融合基因。本专利技术还提供了一种重组菌，其特征在于，含有上述的重组质粒。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术通过同源重组的方式，将抗性标记基因插入聚酮合酶基因pks中，敲除pks基因得到赭曲霉突变菌株。该菌株失去合成聚酮合酶的能力，进而阻断了OTA的合成，为其在工业生产中的广泛应用奠定基础。保藏信息赭曲霉毒素A基因敲除的赭曲霉突变菌株，该突变菌株赭曲霉MF018(AspergillusochrataeMF018)现保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(地址在中国武汉武汉大学)，保藏日期为2019年3月21日，保藏编号为CCTCCNO：M2019186。附图说明图1：基因敲除重组质粒构建示意图。图2：重组质粒PCR鉴定结果示意图。其中泳道1-2为p-u1、p-d1和抗性标记基因构建获得的融合基因PCR产物(3610bp)；泳道3为DNAMarker。图3：赭曲霉毒素A基因敲除突变株PCR鉴定结果示意图。其中泳道1为DNAMarker；泳道2-3为原始菌pks基因PCR产物；泳道4-5：赭曲霉毒素A基因敲除突变株融合基因PCR产物。具体实施方式以下通过具体的实施案例进一步对专利技术进行说明，不能理解为是本专利技术的限制，实施案例中使用的材料、试剂、仪器设备如无特殊说明，均可从商业途径获得。1.菌株和质粒赭曲霉菌株来自于本实验室收藏，该菌种已在CN108823266A《一种采用发酵的方法制备几丁质的方法》中公开，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)中，保藏日期为2018年4月25日，保藏号为CGMCCNo.15668。质粒pMD18-TsimpleVector购于TakaRa公司，质粒pSilent-Dual1和pAg1-H3购于淼灵质粒平台，质粒pBC-Hygro购于丰晖生物。2.培养基(1)LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L。LB固体培养基1L在与LB液体培养基一样的成分基础上，加本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种赭曲霉毒素A基因敲除的赭曲霉突变菌株，保藏编号为CCTCC NO：M2019186。/n

【技术特征摘要】
1.一种赭曲霉毒素A基因敲除的赭曲霉突变菌株，保藏编号为CCTCCNO：M2019186。


2.权利要求1所述的赭曲霉毒素A基因敲除的赭曲霉突变菌株的构建方法，其特征在于，包括：
步骤1：克隆赭曲霉聚酮合酶编码基因pks；
步骤2：克隆选择性标记抗性基因；
步骤3：构建含有pks上下游关键DNA序列p-u1、p-d1和所述的选择性标记抗性基因的融合基因，并将融合基因插入质粒构建重组质粒；
步骤4：重组质粒转化大肠杆菌DH5α，培养并筛选转化子进行重组质粒验证；
步骤5：制备赭曲霉原生质体；
步骤6：重组质粒转化赭曲霉原生质体；
步骤7：培养和筛选转化后的赭曲霉获得赭曲霉阳性转化子；
步骤8：对阳性转化子进行基因水平的验证，获得赭曲霉毒素A基因敲除的赭曲霉突变菌株。


3.如权利要求2所述的赭曲霉毒素A基因敲除的赭曲霉突变菌株的构建方法，其特征在于，所述的质粒为pSilent-Dual1...

【专利技术属性】
技术研发人员：李茜茜，时丽，荣绍丰，管世敏，张硕，蔡宝国，刘颖颖，
申请(专利权)人：上海应用技术大学，
类型：发明
国别省市：上海;31