针对抗原的保护性免疫的诱导制造技术

本文描述了用于制备和使用能够调节减毒和/或调节一种或多种感兴趣抗原的表达的重组细菌的组合物和方法。

Induction of protective immunity against antigens

Compositions and methods for the preparation and use of recombinant bacteria capable of modulating the detoxification and / or expression of one or more antigens of interest are described.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】针对抗原的保护性免疫的诱导相关申请本申请要求于2017年1月23日提交的美国临时申请号62/449,228和于2017年8月4日提交的美国临时申请号62/541,293的优先权。前述申请的全部内容各自通过引用明确并入本文。该申请的序列表标记为“Seq-List.txt”，其创建于2018年1月23日并为31KB。该序列表的全部内容通过引用并入本文。本专利技术是在美国国立卫生研究院授予的AI093348、AI056289和AI126712的政府支持下完成的。政府拥有本专利技术的某些权利。
技术介绍
肠道沙门氏菌(Salmonellaenterica)在全球人类中造成负担沉重的疾病。伤寒沙门氏菌及甲型、乙型和丙型副伤寒沙门氏菌(ParatyphiA,BandC)会引起肠热症(1)并且是重大的公共卫生问题(2-4)。据估计，伤寒沙门氏菌每年在全球导致超过2060万病例、433,000例死亡(5,6)和1220万个伤残调整生命年(7)。除了这些血清型(serovars)外，非伤寒沙门氏菌(nontyphoidalSalmonella)(NTS)越来越多地被认为是侵袭性疾病(2,8,9)例如败血症和脑膜炎的重要原因，全球每年有9380万病例和681,300例死亡(10,11)。NTS也是美国因食源性疾病而住院和死亡的首要原因(12)，每年有约120万例炎症性腹泻病，导致23,000例住院和450例死亡(12,13)，由于早亡、残疾、医疗和生产力成本及每年16,782个质量调整生命年的损失，经济损失大约为33.1亿美元(14)。在<5岁的儿童中，NTS是最主要的细菌病原体并导致4670例住院和38例死亡(15)。在美国，NTS疾病主要由属于三种血清型B、D和C的血清型所致(16)。肠炎(Enteritidis)血清型、鼠伤寒(Typhimurium)血清型、纽波特(Newport)血清型和海德尔堡(Heidelberg)血清型是美国最常见的疫情(17)。尽管绝大多数患者出现以炎症性腹泻为特征的自限性胃肠炎，但NTS也可引起全身性疾病并且是美国主要在免疫低下的人中由与病毒、寄生虫或细菌相关的食源性疾病导致的死亡的单一最常见原因(18)。在小孩和HIV感染个体中，NTS频繁地引起与高死亡率相关的全身性感染(19)。在世界上许多地区，尤其是撒哈拉以南非洲地区，AIDS的增加已导致NTS相关全身性感染的频率的急剧增加(20,21)。菌血症(Bacteremia)是最严重的症状，并且到达诊所的菌血症儿童的死亡率可能接近25％(18,21)。因为多重耐药(22,23)的沙门氏菌的增加，肠热症和NTS变得越来越难以用抗生素治疗，导致无法治愈的病例数越来越多的风险(24,25)。几种疫苗可预防肠热症(26,27)。伤寒和副伤寒血清型的灭活全细胞制剂可有效减少流行地区的发病率(28)，但由于频繁的不良反应而停药(29)。通过化学诱变生成的减毒活伤寒沙门氏菌菌株Ty21a仅针对伤寒血清型提供至多三年的中等水平保护，而对其他相关的血清型不提供保护(29,30)。另外的遗传修饰沙门氏菌菌株已在临床试验中进行了测试，取得了一些成功，但尚没有一个得到批准。伤寒血清型的纯化荚膜碳水化合物Vi会在数年内对伤寒和可能地丙型副伤寒诱导保护性免疫，但不对所有缺乏此荚膜(capsule)的甲型和乙型副伤寒或鼠伤寒诱导保护性免疫(31)。Vi与蛋白抗原的接合将改善婴儿的免疫应答，婴儿是肠热症的主要易感人群。为了覆盖重要的甲型副伤寒血清型，目前的努力集中在将O-抗原(脂多糖(LPS)的碳水化合物部分)与蛋白抗原连接起来(27)。这两种商业疫苗主要用于旅客(traveler)疫苗市场，并且自20世纪90年代以来没有任何新的疫苗得到广泛使用的许可(26)。尽管目前商业上可获得三种针对伤寒沙门氏菌的疫苗，但遗憾的是，仍没有一种针对甲型副伤寒沙门氏菌的许可疫苗，可获得的伤寒沙门氏菌疫苗仅提供非常小(如果有的话)的交叉保护作用。有针对肠炎和鼠伤寒NTS血清型的疫苗，这些疫苗对农场动物如家禽和猪有效(32)，但在人类中不可用(33)。这代表着现有预防策略的重大限制。因此，全身性沙门氏菌病的治疗已变得越来越困难，目前针对沙门氏菌的疫苗仅在节制(moderated)的水平上提供有限的保护期限和临床相关血清型的有限覆盖。这些情况产生了对改进的沙门氏菌疫苗的紧急医疗需求。已经研究了重组减毒沙门氏菌疫苗(RASV)作为疫苗或异源抗原递送系统的用途，因为它们具有在局部和远端位点刺激全身和粘膜免疫应答的能力及作为产生和呈递重组疫苗抗原的载体的优势。RASV可用于多种应用，包括但不限于针对引起疾病、癌症、慢性呼吸道疾病和心脏疾病的病原体的疫苗接种。近来已开发出受调节的延迟减毒RASV(RDARASV)以增强对RASV和携带的保护性抗原的免疫应答。对RDARASV进行工程改造，使得关键毒力因子的基因处于由哺乳动物宿主中未发现的阿拉伯糖诱导的诱导型启动子ParaBAD的控制之下。使RDARASV在阿拉伯糖的存在下体外生长使得表达介导致病表型的基因并且RASV展示野生型的特征以侵入到宿主中。由于体内不存在阿拉伯糖，故致病基因的表达将停止，基因产物因复制而稀释，从而产生减毒表型而不引起疾病。由于它们最初以完全毒力复制，故它们以更高的水平定殖淋巴组织以引发比组成型减毒RASV更强的免疫应答。还开发了受调节的延迟蛋白合成(RDPS)以增强免疫原性。增加的抗原合成水平有助于增加关联(cognate)T细胞与抗原呈递细胞(APC)相互作用的机会，从而导致效应分子的有效增殖和产生及体内T细胞增殖。然而，高水平的抗原合成将强加代谢需求，这些需求将损害菌株定殖效应淋巴组织的能力。RDPS系统仅在RASV定殖淋巴组织后随着RASV细胞在体内繁殖才产生重组疫苗抗原。该策略不受减毒模式的影响。尽管使用重组沙门氏菌作为活疫苗在受试者中产生免疫应答是有前景的，但这些生物体是活的并且有时是致病的。相应地，有必要向细菌中引入调节系统以减弱和控制由细菌表达的抗原的表达。目前采用的减毒手段使活疫苗菌株对体内环境胁迫敏感。因此，很少有细菌能够定殖宿主细胞以达到所期望的免疫原性水平。因此，需要可开发用作活疫苗的重组微生物新菌株，其对体内环境胁迫较不敏感，并且其可定殖宿主细胞以取得更好的免疫原性水平。还需要新的手段来增强减毒活疫苗在体内的安全性。
技术实现思路
本公开提供了重组细菌包括沙门氏菌的菌株，其依赖于三种糖通过控制多重毒力基因和感兴趣抗原的表达以及受调节的延迟裂解表型来调节细菌的毒力表型，从而允许免疫原性的生物牵制(containment)和增强。可受一种或多种糖调节的其他属性包括如美国专利申请公开号2014/0370057中所述(例如，在口服免疫期间)的耐酸性，其全部内容通过引用明确并入本文。考虑到生物体在自然发生的环境中不大可能遇到所有三种糖，故对三种糖的依赖性将增强重组细菌的安全性。令人惊奇的是，本专利技术证实可成功地使用三种不同的糖来调节重组细菌的属性(例如，编码感兴趣抗原的基因的表达、延迟裂解表型和/或本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种致病细菌的重组衍生物，所述重组衍生物包含：/na.受第一糖调节的第一基因，其赋予第一表型；/nb.受第二糖调节的第二基因，其赋予第二表型；和/nc.受第三糖调节的第三基因，其赋予第三表型；/n其中所述第一、第二和第三表型选自：/n1.受调节的延迟减毒；/n2.感兴趣抗原的受调节的延迟表达；/n3.体内受调节的延迟裂解；/n4.受调节的O-抗原合成；/n5.受调节的O-抗原侧链合成；/n6.受调节的用于膜抗原的通用模块(GMMA)的产生；/n7.受调节的增强的宿主胁迫条件下的存活；和/n8.受调节的外膜囊泡(OMV)的产生。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170123 US 62/449,228;20170804 US 62/541,2931.一种致病细菌的重组衍生物，所述重组衍生物包含：
a.受第一糖调节的第一基因，其赋予第一表型；
b.受第二糖调节的第二基因，其赋予第二表型；和
c.受第三糖调节的第三基因，其赋予第三表型；
其中所述第一、第二和第三表型选自：
1.受调节的延迟减毒；
2.感兴趣抗原的受调节的延迟表达；
3.体内受调节的延迟裂解；
4.受调节的O-抗原合成；
5.受调节的O-抗原侧链合成；
6.受调节的用于膜抗原的通用模块(GMMA)的产生；
7.受调节的增强的宿主胁迫条件下的存活；和
8.受调节的外膜囊泡(OMV)的产生。


2.根据权利要求1所述的细菌，其中所述第一糖、第二糖和第三糖各自为不同的糖。


3.根据权利要求2所述的细菌，其中所述第一糖、第二糖或第三糖中的任何一个不干扰受不同的糖调节的基因的调节。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的细菌，其中所述第一糖选自阿拉伯糖、甘露糖、木糖、半乳糖、鼠李糖和麦芽糖。


5.根据权利要求1-4中任一项所述的细菌，其中所述第二糖选自阿拉伯糖、甘露糖、木糖、半乳糖、鼠李糖和麦芽糖。


6.根据权利要求1-5中任一项所述的细菌，其中所述第三糖选自阿拉伯糖、甘露糖、木糖、半乳糖、鼠李糖和麦芽糖。


7.根据权利要求1-6中任一项所述的细菌，其中所述第一基因可操作地连接至第一糖可调节的启动子。


8.根据权利要求1-7中任一项所述的细菌，其中所述第二基因可操作地连接至第二糖可调节的启动子。


9.根据权利要求1-8中任一项所述的细菌，其中所述第三基因可操作地连接至第三糖可调节的启动子。


10.根据权利要求1所述的细菌，其中修饰基因以使得能够可逆地合成赋予糖可调节的表型的含糖分子。


11.根据权利要求10所述的细菌，其中所述修饰的基因为pmi。


12.根据权利要求10所述的细菌，其中所述修饰的基因为galE。


13.根据权利要求1-12中任一项所述的细菌，其中所述细菌为革兰氏阴性菌。


14.根据权利要求1-13中任一项所述的细菌，其中所述细菌属于肠杆菌科。


15.根据权利要求1-14中任一项所述的细菌，其中所述表型为受调节的延迟减毒，并且赋予所述表型的基因为fur。


16.根据权利要求1-14中任一项所述的细菌，其中所述表型为感兴趣抗原的受调节的延迟表达，并且赋予所述表型的基因编码感兴趣抗原。


17.根据权利要求1-14中任一项所述的细菌，其中所述表型为体内受调节的延迟裂解，其中由于sifA基因中的突变，所述裂解能够在细胞溶质中发生。


18.根据权利要求1-14中任一项所述的细菌，其中所述表型为受调节的O-抗原合成，并且赋予所述表型的基因选自waaG、rfaH、waaJ、wbaP、wzy、waaP、waaO、waaF、waaP、waaC、waaA、waaL和wbaP。


19.根据权利要求1-14中任一项所述的细菌，其中所述表型为用于膜抗原的通用模块(GMMA)或外膜囊泡的产生，并且赋予所述表型的基因选自ybgC、tolQ、tolA、tolR、tolB、paI和ybgF。


20.根据权利要求1-14中任一项所述的细菌，其中所述表型为受调节的O-抗原侧链合成，并且赋予所述表型的基因为tolR。


21.根据权利要求1-14中任一项所述的细菌，其中所述第一表型为受调节的O-抗原合成和所述第二表型为GMMA或外膜囊泡的产生。


22.根据权利要求1-21中任一项所述的细菌，其中所述细菌还包含编码感兴趣抗原的基因，其不与糖可调节的启动子可操作地连接。


23.根据权利要求1-22中任一项所述的细菌，其中所述细菌包含内源O-抗原合成基因的缺失。


24.根据权利要求23所述的细菌，其中所述内源O-抗原合成基因的缺失包含所述基因的部分缺失。


25.根据权利要求23所述的细菌，其中所述内源O-抗原合成基因的缺失包含所述基因的全长缺失。


26.根据权利要求23-25中任一项所述的细菌，其中所述O-抗原合成基因为waaL或wbaP。


27.根据权利要求1-26中任一项所述的细菌，其中所述细菌包含内源磷酸甘露糖异构酶基因的缺失。


28.根据权利要求27所述的细菌，其中所述内源磷酸甘露糖异构酶基因的缺失包含所述基因的部分缺失。


29.根据权利要求27所述的细菌，其中所述内源磷酸甘露糖异构酶基因的缺失包含所述基因的全长缺失。


30.根据权利要求27-29中任一项所述的细菌，其中所述磷酸甘露糖异构酶基因为pmi。


31.根据权利要求1-30中任一项所述的细菌，其中所述细菌包含内源tol-pal系统基因的缺失。


32.根据权利要求31所述的细菌，其中所述内源tol-pal系统基因的缺失包含所述基因的部分缺失。


33.根据权利要求32所述的细菌，其中所述内源tol-pal系统基因的缺失包含所述基因的全长缺失。


34.根据权利要求31-33中任一项所述的细菌，其中所述内源tol-pal系统基因选自ybgC、tolQ、tolA、tolR、tolB、paI和ybgF。


35.根据权利要求1-34中任一项所述的细菌，其中所述第一基因、第二基因和/或第三基因位于所述细菌中的质粒上。


36.根据权利要求1-34中任一项所述的细菌，其中所述第一基因、第二基因和/或第三基因位于所述细菌中的染色体上。


37.根据权利要求7-9中任一项所述的细菌，其中所述第一、第二或第三糖可调节的启动子为鼠李糖可调节的启动子。


38.根据权利要求37所述的细菌，其中所述鼠李糖可调节的启动子为rhaSRPrhaBAD。


39.根据权利要求7-9中任一项所述的细菌，其中所述第一、第二或第三糖可调节的启动子为阿拉伯糖可调节的启动子。


40.根据权利要求39所述的细菌，其中所述阿拉伯糖可调节的启动子为araCParaBAD。


41.根据权利要求1-40中任一项所述的细菌，所述细菌还包含内源relA基因的缺失。


42.根据权利要求41所述的细菌，其中所述内源relA基因的缺失为所述基因的部分缺失。


43.根据权利要求41所述的细菌，其中所述内源relA基因的缺失为所述基因的全长缺失。


44.根据权利要求1-43中任一项所述的细菌，所述细菌还包含编码LacI阻遏子的核酸。


45.根据权利要求44所述的细菌，其中所述LacI阻遏子由lacI基因编码。


46.根据权利要求44或...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·柯蒂斯三世，王世峰，
申请(专利权)人：佛罗里达大学研究基金公司，
类型：发明
国别省市：美国;US