本发明专利技术公开了一种检测蛋白磷酸化和乙酰氨基葡萄糖化关联作用的方法，所述方法包括以下步骤：将胰蛋白酶处理得到的多肽样品平均分配成三等分，第一个等分用磷酸酶处理，用IBT‑10Plex116C标记；第二个等分用O‑乙酰葡萄糖胺水解酶处理，用IBT‑10Plex117N标记；第三等分无特殊处理，用IBT‑10Plex118N标记；样品混合，与氢氧化钡、一个含有生物素和巯基的双官能团化合物反应，通过链霉亲和素蛋白‑磁珠从混合物中被亲和富集；用紫外光光照除去含巯基化合物的其他结构，得到多肽衍生物用于质谱分析。本发明专利技术可以找出整个蛋白质组中同时具有磷酸化和O‑GlcNAcylation的Ser/Thr位点，为有氧糖酵解和信号转导通道之间的关系提供了具体数据，促进癌细胞特定生物标志物的发现，用于肿瘤的早期诊断以及治疗药物新靶点。
【技术实现步骤摘要】
一种检测蛋白磷酸化和乙酰氨基葡萄糖化关联作用的方法
本专利技术涉及合成化学、质谱分析、生物
，具体为一种检测蛋白磷酸化和乙酰氨基葡萄糖化关联作用的方法。
技术介绍
癌细胞通常依靠有氧糖酵解(aerobicglycolysis)来提供能量和快速增长所需要的构件分子(氨基酸，核苷酸等)。每个葡萄糖分子所产生的三磷酸腺苷(ATP)在这种不寻常的代谢途径中比在正常细胞中的氧化磷酸化(oxidativephosphorylation)要少得多。因此，为满足快速生长的需求，癌细胞的葡萄糖摄取率高，有氧糖酵解活跃。这种现象，称为瓦伯格效应(WarburgEffect)，是与肿瘤的进展密切相关的。因此，针对肿瘤的高葡萄糖需求是一种很有希望的诊断和治疗方法。例如，有氧糖酵解的一种抑制剂，2-脱氧葡萄糖，目前在临床试验中治疗前列腺癌。另一种葡萄糖相似物，18F-葡萄糖，在正电子发射断层扫描(PET)中广泛应用于肿瘤图像显示。瓦伯格效应如何促进癌细胞的代谢和繁殖的具体机制仍然缺乏明确的理论。因为通常情况下，2-5％由细胞摄入的葡萄糖进入氨基己醣生物合成途径，产生了一种高能核苷糖分子，乙酰氨基葡萄糖尿苷二磷酸(uridinediphosphateN-acetylglucosamine,UDP-GlcNAc)。瓦伯格效应的一个后果是癌细胞中产生高水平的乙酰氨基葡萄糖尿苷二磷酸。这是一种非常常见的蛋白质翻译后修饰的前体分子，也就是在丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr)上的N-乙酰氨基葡萄糖化(O-GlcNAcylation)。高浓度的葡萄糖通过瓦伯格效应进入癌细胞，从而调节细胞内O-GlcNAc的水平。由于蛋白质中的Ser/Thr同时也是另外一种普遍的蛋白质翻译后修饰磷酸化的位点，O-GlcNAcylation必然会影响到相应位点上的磷酸化。众多的研究已经表明蛋白磷酸化是刺激肿瘤生长和转移的一个重要途径，因此，蛋白O-GlcNAcylation能够通过和磷酸化的关联作用，将有氧糖酵解与肿瘤进展相关的细胞信号通路联系起来(ComerandHart2000；Hartetal.2011)。例如，内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)中的Ser1177就可以同时被磷酸化和O-GlcNAcylation。当O-GlcNAcylation增加时，Ser1177的磷酸化减少，内皮型一氧化氮合成酶的活性也相应减小。
技术实现思路
本项专利技术公开了一种新型定量蛋白质组学工具，用于探索癌细胞中蛋白磷酸化和O-GlcNAcylation之间的关联作用。本专利技术可以找出整个蛋白质组中同时具有磷酸化和O-GlcNAcylation的Ser/Thr位点，给理解有氧糖酵解和信号转导通道之间的关系提供了具体数据，从而可以促进癌细胞特定生物标志物的发现，用于肿瘤的早期诊断以及治疗药物新靶点。为了达到以上目的，本专利技术提供如下技术方案：一种用IBT(IsobaricTag)技术确定蛋白磷酸化和O-GlcNAcylation的关联作用的定量蛋白质组学方法，所述方法包括以下步骤：1)将胰蛋白酶处理得到的多肽样品平均分配成三等分，将三等分分别进行以下处理：第一个等分用磷酸酶处理；第二个等分用O-乙酰葡萄糖胺水解酶处理；第三等分无特殊处理；2)第一等分用用IBT-10Plex116C标记；第二等分用IBT-10Plex117N标记；第三等分用IBT-10Plex118N标记；IBT试剂可以与多肽的N-端胺基和C-端赖氨酸侧链胺基反应。3)将第二步处理后的三等分的样品混合，先与氢氧化钡或者其他合适的碱性溶液混合；然后与一个含有生物素和巯基的双官能团化合物反应，通过链霉亲和素蛋白-磁珠从混合物中被亲和富集；然后用365nm紫外光光照除去含巯基化合物的其他结构，得到多肽用于质谱分析。进一步的，所述含有生物素和巯基的双官能团化合物为半胱氨酸衍生物Cys-Dev，所述Cys-Dev包括生物素(Biotin)、水溶性荧光基团(Water-soluablefluorecentgroup)、光可断裂链接键(light-cleavablelinker)、半胱氨酸。半胱氨酸的结构提供了一个巯基，可以与脱氢丙氨酸中的碳-碳不饱和双键反应，同时一个胺基可以提高标记后的多肽在质谱中的离子化。生物素(Biotin)和链霉亲和素蛋白之间的作用力是自然界中存在的最强非共价作用力，因此在生物技术应用中常作为亲和富集基团。一个水溶性的磺酸基可以提高Cys-Dev在水溶液中的溶解度，同时这个基团具有荧光(water-soluablefluorescentgroup)，有助于整个实验过程中的监控。半胱氨酸部分与其他结构部分是通过一个可通过紫外光光照裂解的共价键链接的(light-cleavablelinker)。进一步的，步骤1)的样品进行预处理，预处理方法为：细胞保持在所提供的含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM溶液中，温控37℃，以及保持5％CO2。在无血清培养基中培养细胞48个小时。通过离心收获细胞，并且用PBS洗涤两次以除去培养基，加入缓冲液，同时加入磷酸酶抑制剂(phosphataseinhibitorcocktail)和O-GlcNAcase抑制剂(ThiametG)。用超声打碎细胞后离心，收集上层清液后，加入5倍的丙酮沉淀蛋白。收集蛋白沉淀并用含有8M尿素的HEPES缓冲液(pH7.0)溶解，加入DTT溶液还原二硫键，然后加入2-碘乙酰胺烷基化所有的半胱氨酸。将溶液稀释10倍后，加入胰蛋白酶，在37℃下保持8个小时。在C18柱除盐，用1：1的水：乙腈收集后的多肽(～2mg)经冷冻干燥后在-20℃保存。进一步的，所述步骤2)中，标记反应分别进行2小时后混合，加入氢氧化钡溶液，在室温下静置1小时，加入稀盐酸调节pH7，然后加入Cys-Dev，反应进行2小时后，过量的Cys-Dev用表面由NHS活化的琼脂糖珠除去，剩余溶液继续用链霉亲和素蛋白-磁珠富集，磁珠经洗涤后，悬浮在4:1的水：乙腈中，保持磁珠均匀分布，用365nm的紫外光(10mW/cm2)照射15分钟，收集液体并旋干；处理后的样品直接用于LC-MS/MS。通过一对多肽(TQpSFSLQER，TQgSFSLQER，其中p代表磷酸化，g代表O-GlcNAc)来具体描述本专利技术的流程。这一对多肽是eNOS蛋白经过胰蛋白酶水解后，含有Ser1177的多肽片段(1175-1183)。因为Ser1177在细胞中可以同时磷酸化和O-GlcNAcylation,经胰蛋白酶水解后的eNOS同时含有这一对多肽，其比例决定于磷酸化和O-GlcNAcylation之间的相对水平。这样的多肽样品可以被平均分配成三等分。第一个等分用磷酸酶(phosphatase)处理以去除TQpSFSLQER上的磷酸根，这样处理后的样品含有(TQSFSLQER，TQgSFSLQER)，加热对磷酸酶灭活后，用IBT-10Plex116C标记。第二等分用O-乙酰葡萄糖胺水解酶(O-GlcNAcase)处理以去除TQgSFSLQER上的O-Gl本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测蛋白磷酸化和乙酰氨基葡萄糖化关联作用的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：/n1)将胰蛋白酶处理得到的多肽样品平均分配成三等分，将三等分分别进行以下处理：第一个等分用磷酸酶处理；第二个等分用O-乙酰葡萄糖胺水解酶处理；第三等分无特殊处理；/n2)第一等分用IBT-10Plex116C标记；第二等分用IBT-10Plex117N标记；第三等分用IBT-10Plex118N标记；IBT试剂可以与多肽的N-端胺基和C-端赖氨酸侧链胺基反应；/n3)将第二步处理后的三等分的样品混合，先与碱性溶液混合；然后与一个含有生物素和巯基的双官能团化合物反应，通过链霉亲和素蛋白-磁珠从混合物中被亲和富集；然后用紫外光光照除去该化合物的其他结构，得到多肽衍生物用于质谱分析。/n
【技术特征摘要】
1.一种检测蛋白磷酸化和乙酰氨基葡萄糖化关联作用的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
1)将胰蛋白酶处理得到的多肽样品平均分配成三等分，将三等分分别进行以下处理：第一个等分用磷酸酶处理；第二个等分用O-乙酰葡萄糖胺水解酶处理；第三等分无特殊处理；
2)第一等分用IBT-10Plex116C标记；第二等分用IBT-10Plex117N标记；第三等分用IBT-10Plex118N标记；IBT试剂可以与多肽的N-端胺基和C-端赖氨酸侧链胺基反应；
3)将第二步处理后的三等分的样品混合，先与碱性溶液混合；然后与一个含有生物素和巯基的双官能团化合物反应，通过链霉亲和素蛋白-磁珠从混合物中被亲和富集；然后用紫外光光照除去该化合物的其他结构，得到多肽衍生物用于质谱分析。
2.如权利要求1所述的一种检测蛋白磷酸化和乙酰氨基葡萄糖化关联作用的方法，其特征在于：所述含有生物素和巯基的双官能团化合物为半胱氨酸衍生物Cys-Dev，所述Cys-Dev包括生物素、水溶性磺酸基、光可断裂链接键、半胱氨酸。
3.如权利要求1所述的一种检测蛋白磷酸化和乙酰氨基葡萄糖化关联作用的方法，其特征在于：步骤1)的样品进行预处理，预处理方法为：细胞保持在所提供的含有10％胎牛血清的DMEM溶液中，温控37℃，以及保持5％CO2；在无血清培养基中培养细胞48个小时；通过离心收获细胞，并且用PBS洗涤两次以除去培养基，加入缓冲液，同时加入磷酸酶抑制剂和O-GlcNAcase抑制剂；用超声打碎细胞后离心，收集上层清液后，加入5倍的丙酮沉淀蛋白；收集蛋白沉淀并用含有8M尿素的HEPES缓冲液溶解，加入DTT溶液还原二硫键，然后加入2-碘乙酰胺烷基化所有的半胱氨酸；将溶液稀释10倍后，加入胰蛋白酶，在37℃下保持8个小时；在C18柱除盐，用1：1的水：乙腈收集后的多肽经冷冻干燥后在-20℃...
【专利技术属性】
技术研发人员：李舒伟，丁慧娜，
申请(专利权)人：南京谱利健生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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