利用液相色谱串联质谱测定蜂蜜中意蜂MRJP1蛋白含量的方法技术

本发明专利技术提供一种利用液相色谱串联质谱测定蜂蜜中意蜂MRJP1蛋白(王浆主蛋白1)含量的方法，所述方法包括：特征肽段的选择，制作标准曲线，样品前处理，液相色谱分离以及串联质谱检测定量等步骤。本发明专利技术提供的蜂蜜中意蜂MRJP1含量的检测方法，具有特异性强、灵敏度高、准确度和精确度好等优点，适合于蜂蜜中意蜂MRJP1的准确定量。由于蜂蜜中MRJP1的含量相对恒定，基于其含量可用于蜂蜜真实性评价，辅助鉴别蜂蜜是否掺假。此外，中蜂蜂蜜中不含有意蜂MRJP1，因此可以用于中蜂蜂蜜中是否混入意蜂的鉴别。该方法对于维护蜂蜜消费行业健康发展和蜂蜜消费者的权益意义重大。

Determination of mrjp1 protein in honey by liquid chromatography tandem mass spectrometry

【技术实现步骤摘要】
利用液相色谱串联质谱测定蜂蜜中意蜂MRJP1蛋白含量的方法
本专利技术涉及食品检测领域，具体地说，涉及一种利用液相色谱串联质谱测定蜂蜜中意蜂MRJP1蛋白含量的方法。
技术介绍
蜂蜜是蜜蜂采集蜜源植物的花蜜或蜜露与其分泌物混合，经过一段时间酿制后形成的一类具有甜味食品。蜂蜜作为传统的天然食品，具有美容、养颜、安神等保健功能，深受百姓喜爱。蜂蜜的生产劳动强度高、周期长、产量易受到蜜源、天气等因素影响，从而导致蜂蜜的生产成本较高，总产量有限，导致市场上的蜂蜜供不应求。不法企业为了追逐巨额利润，在蜂蜜的生产、加工、销售等环节，通过掺入蔗糖、转化糖、果糖、葡萄糖、果葡糖浆等制造掺假蜂蜜，严重扰乱了蜂蜜的正常生产及销售秩序，阻碍了我国蜂业的健康发展，侵害了消费者权益。因此加强对蜂蜜真伪鉴别技术的研究是目前亟需开展的工作。王浆主蛋白1(majorroyaljellyprotein1，MRJP1)，是蜂蜜中的主要蛋白质之一，大小约57KD，占水溶性蛋白质的45％，是蜂蜜中含量最丰富的蛋白质。研究结果表明MRJP1的含量相对恒定，若是掺入了糖浆等外源性物质，则其含量必定发生较大的变化，因此MRJP1含量可用以辅助鉴别蜂蜜的掺假现象。此外，意蜂(意大利蜂)与中蜂(中华蜜蜂)MRJP1的氨基酸序列存在显著的差异，因此，可以意蜂MRJP1的检测可以用于中蜂蜜中是否混入廉价意蜂蜜的鉴别。但是，对于如何准确定量蜂蜜中MRJP1的含量，目前尚无相关报道。液相色谱串联质谱技术由于其高选择性和高灵敏度，非常适用于复杂生物基质中蛋白质的准确表征、鉴定和定量。通过高分辨质谱的蛋白质定量可以通过将蛋白样品用胰蛋白酶消化后检测整个蛋白质或特征肽段来实现。肽段水平的检测可以通过分析靶蛋白质的序列特异于的胰蛋白酶特征肽段来满足定性要求，进而可用于定量。该方法的关键点是为靶蛋白和合适的内标肽段选择一种或多种特异性特征肽段。在此策略的基础上，提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用液相色谱串联质谱测定蜂蜜中意蜂MRJP1蛋白含量的方法。本专利技术的另一目的是将该方法用于生产和商业中对蜂蜜的质量控制和真实性鉴定。为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种利用液相色谱串联质谱测定意蜂蜜中意蜂MRJP1蛋白含量的方法，包括以下步骤：A、提取标准意蜂蜂蜜样品中的蛋白质，进行SDS-PAGE电泳，将MRJP1蛋白对应的条带切胶回收，然后酶解MRJP1蛋白，酶解产物除盐后，用0.1％v/v的甲酸水溶液复溶，然后进行液相色谱串联质谱检测；B、根据液相色谱串联质谱检测结果，筛选出MRJP1蛋白的特征肽段并测序，然后人工合成所述特征肽段及其稳定同位素内标肽段；C、配制不同浓度的所述特征肽段的标准品溶液；D、向标准品溶液中加入稳定同位素内标肽段混匀，然后进行液相色谱串联质谱检测；E、根据标准品溶液的浓度以及特征肽段/稳定同位素内标肽段的峰面积比绘制标准曲线；F、对待测蜂蜜样品进行前处理：先将蜂蜜样品溶解于水或PBS缓冲溶液中，利用超滤法提取蜂蜜中的蛋白质；将蛋白溶液用胰蛋白酶水解，酶解产物除盐后作为待测样本；G、用待测样本替代步骤D中的标准品溶液，采用相同方法进行液相色谱串联质谱检测；H、根据待测样本的检测结果，对照标准曲线，获得待测样本中特征肽段的浓度，从而实现对蜂蜜样品中意蜂MRJP1蛋白的定量检测。本专利技术成功筛选出意蜂MRJP1的特异性肽段FFDYDFGSDER(SEQIDNO:1)，其特异性通过Uniprot数据库进行了验证；并选择稳定的内标(IS)肽段，以便在蜂蜜中准确、灵敏地定量MRJP1蛋白。优选地，所述稳定同位素内标肽段为：FFDYDFGSDER*，其中，R*表示精氨酸中的碳置换为13C6，氮置换为15N。前述的方法，步骤A包括以下子步骤：a1、蜂蜜中蛋白质的提取：将蜂蜜与去离子水或PBS缓冲溶液按照1:1体积比溶解，离心10min，收集上清液至10KD分子通量的超滤管中，以5000g离心力离心，使蛋白溶液浓缩至最小体积，然后收集上清液，作为蛋白提取液，并测定提取液中总蛋白浓度(Bradford法)；a2、蛋白质的SDS-PAGE分析：将蛋白提取液进行SDS-PAGE分析，用12％浓缩胶和10％分离胶将MRJP1与其它蛋白分离，然后用考马斯蓝染色；a3、MRJP1蛋白的酶解：从电泳凝胶上切下MRJP1蛋白对应的条带(约57KD，MRJP1蛋白的氨基酸序列见SEQIDNO:2)，置于离心管中，并用加入脱色液没过凝胶条，旋转进行脱色至无色；弃去脱色液并加入乙腈使切下的凝胶条带脱水，上下颠倒使其反应15min，吸走乙腈并蒸发浓缩干燥；然后加入100mMDTT溶液浸没胶条使其吸胀，在室温反应60min，吸干多余的DTT，再加入100mMIAA溶液在室温下暗反应60min；吸干多余的IAA，向干燥的凝胶块中加入用40mMNH4HCO3溶解的胰蛋白酶(胰蛋白酶与MRJP1蛋白的质量比为1:50)浸没胶条，37℃酶切过夜；然后加入0.1％v/v甲酸水溶液终止酶切反应，加入70％v/v乙腈水溶液(含0.1％v/v甲酸)浸没胶条进行萃取，静置10-20min，将萃取液转移至新的离心管中，重复一次萃取，合并两次萃取液，除盐后将样品进行真空干燥，然后用甲酸水溶液复溶，进行液相色谱串联质谱检测。本专利技术中，可以采用UHPLC-QExactiveplus(超高效液相色谱-四级杆串联高分辨静电轨道阱)进行液相色谱串联质谱检测。优选地，液相色谱条件如下：色谱柱：为C18柱；流动相组成：流动相A为0.1％v/v甲酸水溶液，流动相B为含0.1％v/v甲酸的乙腈；梯度洗脱条件为：0-0.5min，5％的B；0.5-1.0min，5-15％的B；1.0-6.5min，15-40％的B；6.5-7.0min，40-95％的B；7.0-8.5min，95％的B；8.5-8.6min，95-5％B，8.6-10.0min，5％的B；流速：0.30mL/min；进样量：5.0μL。优选地，质谱条件如下：离子源参数：鞘气的流速(sheathgasflowrate)38；辅助气的流速(auxgasflowrate)15；挡锥气的流速(sweepgasflowrate)0；电喷雾电压(sprayvoltage)3.2KV；离子导管的温度(capillarytemperature)275℃；S-lensRFlevel设为60；离子源温度(Heatertemperature)380℃；采集的模式为正离子模式下的FullMS-ddMS2：其中，FullMS的具体参数设置如下：分辨率(Resolution)：70000；AGCTarget：3e6；MaximumIT：100ms；Scanrange：200-1500Da；Spectrumdata：Centroid；Inclusion：on；其中，d本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.利用液相色谱串联质谱测定蜂蜜中意蜂MRJP1蛋白含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：/nA、提取标准意蜂蜂蜜样品中的蛋白质，进行SDS-PAGE电泳，将MRJP1蛋白对应的条带切胶回收，然后酶解MRJP1蛋白，酶解产物除盐后，用0.1％v/v的甲酸水溶液复溶，然后进行液相色谱串联质谱检测；/nB、根据液相色谱串联质谱检测结果，筛选出MRJP1蛋白的特征肽段并测序，然后人工合成所述特征肽段及其稳定同位素内标肽段；/nC、配制不同浓度的所述特征肽段的标准品溶液；/nD、向标准品溶液中加入稳定同位素内标肽段混匀，然后进行液相色谱串联质谱检测；/nE、根据标准品溶液的浓度以及特征肽段/稳定同位素内标肽段的峰面积比绘制标准曲线；/nF、对待测蜂蜜样品进行前处理：先将蜂蜜样品溶解于水或PBS缓冲溶液中，利用超滤法提取蜂蜜中的蛋白质；将蛋白溶液用胰蛋白酶水解，酶解产物除盐后作为待测样本；/nG、用待测样本替代步骤D中的标准品溶液，采用相同方法进行液相色谱串联质谱检测；/nH、根据待测样本的检测结果，对照标准曲线，获得待测样本中特征肽段的浓度，从而实现对蜂蜜样品中意蜂MRJP1蛋白的定量检测；/n其中，所述特征肽段为：FFDYDFGSDER。/n...

【技术特征摘要】
1.利用液相色谱串联质谱测定蜂蜜中意蜂MRJP1蛋白含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、提取标准意蜂蜂蜜样品中的蛋白质，进行SDS-PAGE电泳，将MRJP1蛋白对应的条带切胶回收，然后酶解MRJP1蛋白，酶解产物除盐后，用0.1％v/v的甲酸水溶液复溶，然后进行液相色谱串联质谱检测；
B、根据液相色谱串联质谱检测结果，筛选出MRJP1蛋白的特征肽段并测序，然后人工合成所述特征肽段及其稳定同位素内标肽段；
C、配制不同浓度的所述特征肽段的标准品溶液；
D、向标准品溶液中加入稳定同位素内标肽段混匀，然后进行液相色谱串联质谱检测；
E、根据标准品溶液的浓度以及特征肽段/稳定同位素内标肽段的峰面积比绘制标准曲线；
F、对待测蜂蜜样品进行前处理：先将蜂蜜样品溶解于水或PBS缓冲溶液中，利用超滤法提取蜂蜜中的蛋白质；将蛋白溶液用胰蛋白酶水解，酶解产物除盐后作为待测样本；
G、用待测样本替代步骤D中的标准品溶液，采用相同方法进行液相色谱串联质谱检测；
H、根据待测样本的检测结果，对照标准曲线，获得待测样本中特征肽段的浓度，从而实现对蜂蜜样品中意蜂MRJP1蛋白的定量检测；
其中，所述特征肽段为：FFDYDFGSDER。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A包括以下子步骤：
a1、蜂蜜中蛋白质的提取：将蜂蜜与去离子水或PBS缓冲溶液按照1:1体积比溶解，离心10min，收集上清液至10KD分子通量的超滤管中，以5000g离心力离心，使蛋白溶液浓缩至最小体积，然后收集上清液，作为蛋白提取液，并测定提取液中总蛋白浓度；
a2、蛋白质的SDS-PAGE分析：将蛋白提取液进行SDS-PAGE分析，用12％浓缩胶和10％分离胶将MRJP1与其它蛋白分离，然后用考马斯蓝染色；
a3、MRJP1蛋白的酶解：从电泳凝胶上切下MRJP1蛋白对应的条带，置于离心管中，并用加入脱色液没过凝胶条，旋转进行脱色至无色；弃去脱色液并加入乙腈使切下的凝胶条带脱水，上下颠倒使其均匀反应，吸走乙腈并蒸发浓缩干燥；然后加入100mMDTT溶液浸没胶条使其吸胀，在室温反应60min，吸干多余的DTT，再加入100mMIAA溶液在室温下暗反应60min；吸干多余的IAA，向干燥的凝胶块中加入用40mMNH4HCO3溶解的胰蛋白酶浸没胶条，37℃酶切过夜，其中，胰蛋白酶与MRJP1蛋白的质量比为1:50；然后加入0.1％v/v甲酸水溶液终止酶切反应，加入含0.1％v/v甲酸的70％v/v乙腈水溶液浸没胶条进行萃取，静置10-20min，将萃取液转移至新的离心管中，重复一次萃取，合并两次萃取液，除盐后将样品进行真空干燥，然后用0.1％v/v甲酸水溶液复溶，进行液相色谱串联质谱检测。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤D和G中采用UHPLC-QExactiveplus进行液相色谱串联质谱检测；
(1)液相色谱条件如下：
色谱柱：为C18柱；
流动相组成：流动相A为0.1％v/v甲酸水溶液，流动相B为含0.1％v/v甲酸的乙腈；...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨术鹏，李熠，丛晓蕾，周金慧，张金震，金玥，
申请(专利权)人：中国农业科学院蜜蜂研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11