除草醚半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了除草醚半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用，本发明专利技术提供的除草醚半抗原既最大程度保留了除草醚的特征结构，使得除草醚半抗原的免疫原性明显增强，又具有可以与载体蛋白发生偶联的醛基；用除草醚半抗原与载体蛋白偶联后得到的除草醚人工抗原去免疫动物，更有利于刺激动物免疫应答产生特异性更强、灵敏度更高的抗体，经检测除草醚抗体的灵敏度可达0.1μg/L，与其他农药的交叉反应率低，为后续建立除草醚的各种免疫分析方法提供了基础。

Preparation and application of herbicidal ether hapten, artificial antigen and antibody

【技术实现步骤摘要】
除草醚半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用
本专利技术属于食品安全检测领域。更具体地，本专利技术涉及除草醚半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用。
技术介绍
除草醚(Nitrofen)是一种水旱田除草剂，在各种土质、气温条件下均可适用，主要防治某些一年生阔叶及禾本科杂草，可用于白菜、甘蓝、萝卜、油菜、芥菜、水萝卜、茎兰、菜花、芹菜、胡萝卜、香菜、茵香、葛笋、阁蒿、菠菜等以及某些豆科蔬菜等菜田。除草醚作为醚类选择性触杀型除草剂，由于对试验动物具有致畸、致突变、致癌作用，多数国家已禁止生产和使用。目前，国内外检测除草醚主要有气相色谱法、高效液相色谱法和气相色谱质谱法等分析方法。仪器检测法存在样品前处理繁琐、检测时间长、仪器贵重等缺点，所以在我国无法得到广泛应用，并且不符合现场检测“在短时间内低成本对大量样品进行准确检测和筛选”的要求。而免疫学检测分析技术以其高灵敏、特异性高、快速、操作简便等优点在药物残留检测领域已被广泛应用，比起仪器等检验方法有很多优势。所以免疫分析为除草醚残留研究提供了一条新的分析检测方法。在建立免疫学检测方法并应用该检测方法检测除草醚残留量时，关键技术在于能够获取到特异性强、灵敏度高的抗体，而要实现这一目标，前提条件就是得合成、制备出合适的除草醚半抗原。但是，目前，国内还没有针对除草醚半抗原的相关报道。
技术实现思路
针对现有技术中存在的不足之处，本专利技术提供一种能最大程度保留除草醚的特征结构，又具有一定长度连接臂的半抗原以及这种半抗原的制备方法；以此半抗原制备的人工抗原、检测灵敏度高和特异性强的抗体；以及此半抗原的应用。本专利技术所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：本专利技术的第一个目的是提供一种除草醚半抗原，其具有如下结构式：本专利技术的第二个目的是提供一种除草醚半抗原的制备方法，其是由2,4-二氯苯酚与2-氯-5-硝基苯胺反应得到。进一步地，该制备方法为：取2,4-二氯苯酚加乙腈溶解，加入强碱和无水碘化亚铜，充分搅拌后，加入2-氯-5-硝基苯胺，回流反应12h，反应完毕后，进行分离纯化后得到除草醚半抗原；其中，所述2,4-二氯苯酚、强碱和2-氯-5-硝基苯胺的物质的量之比为1:(1.0-1.5):(1.0-1.2)；所述强碱为KOH、NaOH或NaH中的任意一种。进一步地，该制备方法的具体步骤如下：取2,4-二氯苯酚1.6g加乙腈100mL溶解，加入KOH0.67g和无水碘化亚铜0.7g，充分搅拌后，加入2-氯-5-硝基苯胺1.85g，回流反应12h，反应完毕后降至室温，过滤，滤液蒸干，用60mL体积比为1:3的无水乙醚-正己烷重结晶，得到除草醚半抗原。本专利技术的第三个目的是提供一种除草醚人工抗原，其是载体蛋白和上述除草醚半抗原偶联得到的偶联物。进一步地，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白。本专利技术的第四个目的是提供一种除草醚人工抗原的制备方法，包括如下步骤：将上述除草醚半抗原溶于有机溶剂中，即为A液；将载体蛋白溶解在0.05mol/L的CB缓冲液中，得到B液；以及将所述A液滴加到所述B液中，4℃反应24h，加硼氢化钠，继续搅拌3h，纯化后得到所述除草醚人工抗原。本专利技术的第五个目的是提供一种除草醚抗体，它是由上述除草醚人工抗原经动物免疫得到，其能与除草醚发生特异性免疫反应。进一步地，所述除草醚抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。本专利技术的第六个目的是提供上述除草醚抗体在检测除草醚残留中的应用。本专利技术具有如下有益效果：本专利技术提供的除草醚半抗原既最大程度保留了除草醚的特征结构，使得除草醚半抗原的免疫原性明显增强，又具有可以与载体蛋白发生偶联的醛基；用除草醚半抗原与载体蛋白偶联后得到的除草醚人工抗原去免疫动物，更有利于刺激动物免疫应答产生特异性更强、灵敏度更高的抗体，为后续建立除草醚的各种免疫分析方法提供基础。本专利技术中采用2,4-二氯苯酚与2-氯-5-硝基苯胺反应制备除草醚半抗原，反应步骤简单，所需实验条件温和、易于控制，制备的除草醚半抗原的纯度和产率较高。采用本专利技术的除草醚人工抗原得到的除草醚抗体的效价、特异性、亲和力都较好，灵敏度可达0.1μg/L，与其他农药的交叉反应率低。附图说明图1是本专利技术除草醚半抗原的合成路线具体实施方式第一方面，本专利技术提供一种除草醚半抗原，其具有如下结构式：本专利技术提供的除草醚半抗原既最大程度保留了除草醚的特征结构，使得除草醚半抗原的免疫原性明显增强，又具有可以与载体蛋白发生偶联的醛基；用除草醚半抗原与载体蛋白偶联后得到的除草醚人工抗原去免疫动物，更有利于刺激动物免疫应答产生特异性更强、灵敏度更高的抗体。本专利技术的除草醚半抗原弥补了国内除草醚免疫学检测方法
的空白，为除草醚免疫检测方法的进一步发展奠定了基础。第二方面，本专利技术提供上述除草醚半抗原的制备方法，其是由2,4-二氯苯酚与2-氯-5-硝基苯胺反应得到。优选地，除草醚半抗原的制备方法为：取2,4-二氯苯酚加乙腈溶解，加入强碱和无水碘化亚铜，充分搅拌后，加入2-氯-5-硝基苯胺，回流反应12h，反应完毕后，进行分离纯化后得到除草醚半抗原；其中，所述2,4-二氯苯酚、强碱和2-氯-5-硝基苯胺的物质的量之比为1:(1.0-1.5):(1.0-1.2)。本专利技术在除草醚半抗原的制备中，加入强碱和无水碘化亚铜，强碱起到为后续反应提供碱性条件的作用；无水碘化亚铜是催化剂。本专利技术中，并不具体限定强碱的种类，可以采用已有的各种强碱，作为举例，所述强碱可以为KOH、NaOH或NaH中的任意一种；作为优选，所述强碱为KOH。本专利技术中，2,4-二氯苯酚和2-氯-5-硝基苯胺的物质的量之比需要进行严格限定。若2,4-二氯苯酚的用量过多，则2,4-二氯苯酚反应不完全，影响后续反应效率；若2,4-二氯苯酚的用量过少，不仅造成2-氯-5-硝基苯胺的浪费，而且由于2-氯-5-硝基苯胺本身有黄色，除去这种颜色的过程也非常困难。本专利技术中采用2,4-二氯苯酚与2-氯-5-硝基苯胺反应制备除草醚半抗原，反应步骤简单，所需实验条件温和、易于控制，制备的除草醚半抗原的纯度和产率较高。第三方面，本专利技术还提供一种除草醚人工抗原，其是载体蛋白和上述除草醚半抗原偶联得到的偶联物。优选地，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白。除草醚半抗原分子仅具有免疫反应性，而不具有免疫原性。因此，为了赋予除草醚半抗原分子以免疫原性，还需要将该除草醚半抗原分子与合适的载体蛋白分子偶联、结合在一起，由此产生既具有免疫反应性又具有免疫原性的除草醚人工抗原。第四方面，本专利技术还提供上述除草醚人工抗原的制备方法，包括如下步骤：将上述除草醚半抗原溶于有机溶剂中，即为A液；将载体蛋白溶解在0.05mol/L的CB缓冲液中，得到B液；以及将本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种除草醚半抗原，其特征在于，其具有如下结构式：/n

【技术特征摘要】
1.一种除草醚半抗原，其特征在于，其具有如下结构式：





2.如权利要求1所述的除草醚半抗原的制备方法，其特征在于，其是由2,4-二氯苯酚与2-氯-5-硝基苯胺反应得到。


3.如权利要求2所述的除草醚半抗原的制备方法，其特征在于，该制备方法为：取2,4-二氯苯酚加乙腈溶解，加入强碱和无水碘化亚铜，充分搅拌后，加入2-氯-5-硝基苯胺，回流反应12h，反应完毕后，进行分离纯化后得到除草醚半抗原；其中，所述2,4-二氯苯酚、强碱和2-氯-5-硝基苯胺的物质的量之比为1:(1.0-1.5):(1.0-1.2)；所述强碱为KOH、NaOH或NaH中的任意一种。


4.如权利要求2所述的除草醚半抗原的制备方法，其特征在于，该制备方法的具体步骤如下：取2,4-二氯苯酚1.6g加乙腈100mL溶解，加入KOH0.67g和无水碘化亚铜0.7g，充分搅拌后，加入2-氯-5-硝基苯胺1.85g，回流反应12h，反应完毕后降至...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴小胜，崔海峰，万宇平，马玉华，朱亮亮，王喜平，王兆芹，杨春艳，丛倩千，
申请(专利权)人：北京勤邦生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11